اليوم هنشتغل فقط المرحلة الأولى هي إنه هيكون فيه
عينة water مش مخففة فـ undiluted sample وراح أعمل
منها serial dilution لا تخفيف يعني عشرة أقصال
بواحد وعشرة أقصال باتنين راح أحط لكل تخفيف فيما
فيهم العينة الأصلية هحط لهم خمس إتيوبات وكل إتيوب
فيه تسعة مل من الـ media لـ broth وبعد هيك أعملهم
incubation وبقى أشوف هل فيه تربيتي أو لأ الـ tests
is a method to estimate the concentration of
viable microorganism in sample يعني طريقة الـ MPN
بستخدمها لحتى أكشف عن الـ viable microorganism
الكائنات الحية يعني لو كانت البكتيريا ميتة هل راح
أعرف أستدل على وجودها؟ الجواب لأ، ميتة يعني مش راح
تتموم ما راح تعطي عكارة ولا راح تغير في لون الـ pH
indicator by means of replicate liquid growth
الـ growth in ten-fold dilutions بعمل تخفيفات وبنمي
البكتيريا فيها باستخدام Media broth متى باستعمل
طريقة الـ MPN باستخدمها it's particularly useful
with samples that contain particulate material لما
تكون عند العينات condensed sample عينة فيها
particles كمان باستخدمها في حالة and useful for
low concentration of organisms لما تكون العينة فيها
بكتيريا قليلة Low concentration خاصة في عينات الـ
liquid زي الـ milk والـ water Most probable number
analysis is a statistical method هي طريقة إحصائية
بتعتمد أن يكون فيه توزيع عشوائي للـ microorganism
في العينات Based on the random dispersion توزيع
عشوائي للـ microorganism لهيك ممكن إنه من
الخمستيوبات إيش يطلع فيها positive وإيش يطلع
negative لإنه واحد من اللي لما آخده ممكن أول واحد
منه يكون فيه بكتيريا التاني إنه مثلا مايكون فيه
بكتيريا فهو بيكون باعتماد على التوزيع العشوائي للـ
microorganism فيه العينات In this method, measured
volumes of water بروح أخد volumes محددة من عينتي
اللي هي الـ water بروح أحطها في تيوبات is added to
a series of tubes هاي التيوبات containing a liquid
indicator الـ growth media يعني هيكون فيها media الـ
growth فيها BH indicator بدنا BH Indicator موجود في
الميديا لنشوف هذي البكتيريا عملت fermentation لأ
الـ lactose أو لأ طيب، الـ media receiving one or more
indicator bacteria show growth and characteristic
color change لو العينة فيها indicator bacteria أو
indicator organism المقصود فيها يعني الـ coliform،
الـ fecal coliform، الـ Escherichia coli والـ Enterococcus
لو كانت موجودة، بالتالي هيصير فيها Lactose وكمان
هتغير من لون الـ BH Indicator لأن أحنا قلنا كيف
بقى أستدل على وجود البكتيريا إما من خلال الـ
turbidity لو ما كان فيها BH Indicator أو من خلال
الـ change in color لو كان فيها BH Indicator Color
change is absent يعني مش هيصير تغيير في اللون متى
بتكون هذه الحالة in those receiving an inoculum of
water without indicator bacteria لو كانت عينات
الـ water مافيها indicator bacteria مافيها بكتيريا
بتعمل fermentation للـ lactose فبالتالي مش هيصير تغيير
في لون الـ BH indicator
فقط الكائنات الحية اللي بقدر يعدها بطريقة الـ MPN
أو اللي بقدر أكشف على وجودها لإن الـ dead ما هي حية
معناته بتقدر أنها تعمل تربيتي أو تعمل تغيير إيه كده
إذا في تجربة الميكروبيولوجيا البكتيريا في مجموعة
البريبيرد يمكن أن تجد كواس تشين مرتبطة in chains بقول
ليه ممكن أن البكتيريا تكون موجودة على شكل سلاسل
وهي ما بتنفك حتى لو عملت dilution لإلها not
separated لهيك ما بقدر أحكي أن الوحدة المستخدمة في
الـ MPN هي colony forming unit per gram او مل إنما
بحكي شو MPN colony forming unit أو MPN growth unit
from the number and distribution of positive and
negative reaction the MPN of indicator organism in
the sample may be estimated by reference to
statistical tables يعني أنا قلت بدي أشتغل اليوم
فقط لأول مرحلة اللي هي الـ Presumptive Test روح
يكون عندي إتيوبات فيهم growth media روح أشوف مين
بيصير فيها turbidity مثلا في العينة الـ undiluted
طلع عندي خمسة إن كلهم صار فيهم تغيير في اللون عشرة
أسالب واحد صار فيه إنه مثلا واحد تغيير في اللون
عشرة أسالب اتنين واحد برضه بروح آخد الرقم هاد و
بروح على جدول وبشوف قداش الـ concentration اللي له
فاليوم بدنا نزرع هنيجي تاني يوم أو بعد 48 ساعة
طبعا هذا الشيء باعتمد على الـ microorganism اللي
ببحث عنه هل ببحث على فيكال كوليفارم زي الـ
Escherichia coli أو بابحث على كوليفارم فإحنا
اليوم بدنا نبحث عن الـ Escherichia coli يعني راح
أعمل incubation اللي فيها أربعات وأربعة وربعين ونصف
درجة سيليزيا لمدة 24 ساعة هنيجي نشوف الأنابيب
طبعا احنا اليوم ما راح نستخدم الـ MacConkey broth ولا
الـ LA لأن هم دول مش موجودين عندنا فحنلجأ لـ
Nutrient broth طبعا هاي مافيها pH indicator
فستدل النمو من خلال الـ Turbidity هشوف مين اللي
عمل الـ Turbidity وبكتب عنده positive وبالنهاية
بشوف أكم من positive في كل تخفيف وبروح على جهات
دول وبشوف قداش ممكن يكون الـ concentration اللي
لهم فالـ MPN إلها تلات مراحل الـ Presumptive أو
الـ Screening التانية هي الـ Confirmed Test والتالتة
الـ Completed Test أول مرحلة هي الـ Presumptive أو
الـ Screening Test الهدف منها بتعمل detection أو
estimation للكوليفورم في عينات الـ water for
estimation of coliform لو بدي أبحث عن الكوليفورم
فأنا عارفة في ميزة للكوليفورم إنه بيعمل
fermentation للـ Lactose معناته، الـ medium of
broth اللي عندي ضروري يكون فيها سكر الـ Lactose
Lactose containing broth medium is used بالأمثل على
الـ Broth media اللي فيها اللكتوز إلا الـ MacConkey
Broth هذه فيها BH Indicator اسمه Bromocresol
Purple أو ممكن أستخدم الـ Lauryl Sulfate
Tryptose Broth طيب، إحنا قلنا إن الكوليفورم
بتعمل fermentation لسكر اللكتوز، بتطلع عنه acid
and gas طيب، لو كان فيه pH Indicator باللاحظ إنه
صار fermentation من خلال تغيير في لون الـ pH
Indicator طيب، الـ Gas كيف بدي ألاحظه؟ من خلال
بستخدم الـ Inverted Durham tube يعني بحط الـ
Durham tube بالمقلوب وبالتالي بعمله Incubation
والغاز إذا كان موجود حين حجز في الـ Durham tube The
color of media change into yellow لما يتغير اللون
إلى لون أصفر واللاحظ أنه فيه Gas في الـ Durham tube
معناته البكتيريا High بنفترض إنها تكون كوليفورم لكن
مش متأكدة لإن هاي Screening Test number of positive
tubes are counted بقى أشوف أكام من التيوب عندي
positive أكام من التيوب صار فيه تربيتي اتغير فيه
اللون وبعد هيك بروح أشوف الـ MPN المستنتجة من الـ
number للمية من الـ water لعينتي من خلال chart معين
أو في tables فيه جداول بقى أشوف من خلالها المرحلة
التانية هي الـ confirmed test نلجأ للـ confirmed
test لأن في بعض spore forming بكتيريا بإمكانها
تنمو على الـ presumptive test أو الـ presumptive
media وبتعطي false positive يعني لا هي كوليفورم
ولا هي Escherichia coli مع ذلك بتعطيني positive result
فبتلون الـ media وبتعطي لون أصفر الحل أنه لازم
أعمل confirmed test ليش بأعملهم علشان أتأكد من
البكتيريا هل هي Escherichia coli أو لا، هل هي coliform
أو لا، شو بعمل؟ التيوبات اللي طلعت معي positive في
الـ presumptive test بروح بزرع البكتيريا منها على
Endo-agar أو EMB بعد هيك بعمل incubation حسب هل
بدي على الـ total coliform أو على الـ Escherichia coli
لإن احنا قلنا الـ temperature والـ terminal
incubation بختلفوا حسب نوع الـ microorganism لو
طلع اللون أخضر معناته Escherichia coli لو طلع من درجات
الـ pink to purple معناته fecal coliform
Some spore-forming bacteria give false positive
tests in a presumptive test لهيك وروح نرجع لـ
Confirmed Test بدي أشوف هل هي كوليفورم، هل هي
فيكالكوليفورم، هل هي Escherichia coli أو لأ For this
positive presumptive test are inoculated in
selective media أروح أستخدم ميديا selective EMB أو
Endoagar بعملهم incubation حسب ال temperature قلنا
Presence of typical colonies ع درجة حرارة 37
confirmed positive coliform ع درجة حرارة 44.5 بتأكد
على إن هاي هي Escherichia coli بالنسبة لـ ال
completed test بروح من ال colonies اللي طلعت معي
على الIndo agar أو ال EMB بروح آخذ منهم بعمل sub
culture بروح أحطها في تلات إيتيوبات وبعدين بعملهم
incubation فبدي أدور على الإشريشيا كولاي على درجة
حرارة 44 ونص الإشريشيا كولاي هتعمل fermentation و
هيطلع معها غاز فبلاحظ الغاز على درجة حرارة 44 ونص
بناته هاي إشريشيا كولاي قلنا بدي أحطهم في تلات
إيتيوبات أول إيتيوب بدي يكون تلاتة مل لكتوز بروث
أو BGLB بروث بعدين بروح أحط على slant أجار، slant
بدي يكون مائلاً الهدف منه «for a gram stain» أشتغل
الثالثة بروح أحط فيه الـ «Trypton water» هذا يعتبر
شرط الـ media مشان أشتغل عليها الـ biochemical tests
والفحوصات التعريفية لـ ال micro organism مثلًا فحص
للـ Indole هيبت بيفسر للمرحلة الأولى اللي هي الـ
Presumptive أو الـ Skinneck Test هيكون فيه عند
العينة الأصلية Undiluted Sample وبعدين عملنا
منها تخفيف 1 لـ 10 و1 لـ 100 لكل تخفيف لإضافة لـ
Undiluted Sample هيكون لخمس إيتيوبات فيهم تسعة مل
من الـ Broth Media فيها Lactose وكمان حطوا فيها BH
Indicator اسمه PhenolRed لو البكتيريا بتعمل
fermentation للكتوز هتغير لون البيئة كده إن دكاتر
وهيصير لونها أصفر بعد هيك بعد فترة ال incubation
هنشوف كده طلع معي لونهم أصفر وبنروح للجدول و
بنشوف كده ال most probable number if one
replicated tube of media receive a dilution of the
sample that contains a bacteria cell لو كان فيه
بكتيريا في الثيوب هذا فبالتالي that tube will turn
turbid حيصير فيه turbidity فبأستدل على وجود
البكتيريا من خلال الـ turbidity its neighbor and
identical replicate لو أخدت نفس الـ volume من نفس
العينة ورحت زرعته على الـ tube ثاني may not
receive any bacteria ممكن ما يكون فيها بكتيريا
وبالتالي مارح يظهر turbidity ليش قلنا هذا؟ لأنه
بيكون فيه توزيع random توزيع عشوائي للـ البكتيريا
في العينة this information is particularly useful
at low numbers of organism فهذه الطريقة بتفيد حتى
لو كانت البكتيريا كثيرة قليلة عندي أنه ممكن يكون
أكثر من إيتيوب فبالتالي لو ما طلع في الأول ممكن
يطلع في الثاني بالنسبة للـ Confidence Interval اللي
بدي .. بدي إياكم تفهموه من هذا إنه في طريقة الـ NPN
بأكون متأكدة أو بأثبت وجود البكتيريا أو عدمه بنسبة
95% يعني بنكون واثقين إنه هل هي coliform أو لا، هل
هي Escherichia coli أو لا بنسبة 95% لما أستخدم
طريقة الـ NPN الجدول هذا بيوضح الـ advantages and
disadvantages لطريقة ال NBN بالنسبة لـها الـ
advantage relatively simple and sensitive هي طريقة
بسيطة ما بتحتاج إلى أجهزة معقدة بالإضافة إليها
sensitive عندها القدرة تكشف عن low concentration
of bacteria in sample can count a specific type in
the presence of others يعني بيكون موجود أكثر من
نوع من البكتيريا وأنا بدي أكشف عن الكوليفورم
فبأجيب ميديا خاصة فيها lactose فبأكشف عن هذا النوع
بالذات عن طريقة اللي هي بتعمل fermentation أو لا
Can use large sample volumes احنا قلنا على الأقل
Meat Meal ممكن أنها تكون أكثر من هذا الـ
Disadvantage، time-consuming and labor intensive
يعني أنها تستغرق وقت وجهد الشغلة الثانية، require
large volumes of glassware فيها زجاجيات، يعني
بتحتاج إلى إيتيوبات كثيرة لكل تخفيف تحتاج من 3 إلى
5 إيتيوبات بالإضافة كمان لـ لتيوبات اللي بنعملهم لـ
التخفيفات doesn't give the real value هي ما بتعطيني
التركيز الأكيد هي بتعطيني ال most probable number
الأكثر احتمالًا doesn't give isolated
colonies من خلالها ما بحصل على isolated
colonies نيجي للـ summary The basic concept للـ
MPN method إنه حيصير فيه تخفيف للـ sample to such
a degree that a inoculum in that tubes بعمل تخفيفات
وبعد هذا من كل تخفيف راح آخذ وراح أزرع على إيتيوب
في broth media ممكن هذه الإيتيوبات sometimes but
not always contain viable organism لو كان فيها
بكتيريا حية معناته هي البكتيريا هتغير لون ال media
لو مافيها بكتيريا حية not viable معناته مش حيصير
أي تغيير بعض الـ replicates والـ dilution series
هذا سيكون نتيجة لإجراء عدد مؤكد من عدد الـ most
probable number هي ما بتعطيني exact value قيمة
محددة لما بتعطيني عدد ممكن يكون أكثر احتمالًا The
outcome اللي هو الـ number of inoculate producing a
growth at each dilution العدد اللي بحصل عليه
بالنهاية والـ employ رح يعطينا هو بمثابة مؤشر
لإستنتاج للـ original undiluted concentration of
bacteria مؤشر لقداش كمية البكتيريا في العينة اللي
مش مخففة estimation not exact value while this
method is most commonly used طبعًا الطريقة هي الـ
MPN بيستخدموها في حالة الـ personal product في الـ
medical device في الـ quality control اللي بيشوفوا
له الـ water جودة المياه بالإضافة كمان it has
significant potential for other applications أيضًا
كمان في applications ثانية ممكن تكون مفيدة الطريقة
هذه وبهيك بيكون خلصنا المعمل