نبدأ اليوم إن شاء الله بالمعمل الرابع بعنوان
Arabic Colonic Count بنرمز له ACC أو له مصطلح
ثاني Total Viable Count لاحظوا أنا عمالي بأحكي
كلمة Count معناها فيها عدّ الشغلة، فيها عدّ معناها
هي من ضمن الـ food analysis اللي هي الـ quantitative
مش qualitative، Total يعني عدّ جميع أنواع البكتيريا
بغض النظر عن نوعها، طيب بدي أعدّ الكل يعني الـ media
مش هيكون فيها أي inhibitors، فهي الـ media بيسميها
general media، مثال عليها الـ nutrient agar، viable
يعني بكتيريا حية، بكتيريا حية لأن هذه هي اللي هتكون
عندها القدرة إنها تلمّ و تتكثر أو تتضاعف في الـ size
وسيلها multiplication، وتظهر بالنهاية على شكل
كولونية، نبدأ بملخص للمعمل وبعدين هنمشي على الـ
سلايدات، حكينا إنه في عند الـ sample line خط إنتاج
لكل خط إنتاج له lot، والـ lot له lot number، قلنا من
العجينة أو من الـ lot بأخد حاجة اسمها الـ sample
unit، الـ sample unit على الأقل بتكون 100 جرام أو
مل، ليش 100 على الأقل؟ هيتعتبر statistical
significant، من الـ Sample Unit بأخد منه مقدار من 25
لـ 50 جرام أو مل، سميناها الـ Analytical Unit وهي
هي اللي بشتر عليها في المعمل، اليوم بدنا نعدّي
البكتيريا الموجودة في أي عينة، ممكن نصل لـ، بحكي لي
بمجرد ما تجيني العينة، يستحسن نعملها dilution، نعمل
تخفيف، ليش بدّي أعمل تخفيف للعينة؟ مش إنه أخد العين
مباشرة وأزرعها، لأنه ممكن لو أخدت مباشرة أو زرعتها
هيكون عندي عدد الكولونيات كثير كبير عندي في الطبق
الصعب أنه أنا أعدّه، فإيه الجواب؟ to dilute bacteria
in the sample، مشان أخفف البكتيريا في العينات هي
واحدة الشغلة الثانية to avoid saying لحتى ما يطلع
معي النتيجة to numerous to count TNTC لو طلع العدد
صعب جداً أنه أنا أعدّ أكثر من 250 كولوني في الطبق
بسميها to numerous to count، طيب أنا قلت بدي أخفف
العينة بمجرد ما تصلني بدي أخففها، معناته بحتاج إلى
diluent، شغلات بخفف فيها، عندي ثلاث أنواع لـ diluent
أول شيء الـ normal saline وهذا بدنا نستخدمه بشكل
كبير في ما عملنا، normal saline هو ملح طعام مع
distilled water، هي هيك بس محلول ملح اسمه، التركيز
اللي بيلزمني 85 من 100%، لاحظوا أنه هذا التركيز ما
بعمل shrinking أو swallowing للبكتيريا، ما بيخليها
تتقلص أو أنها تنتفخ، كيف بدي أحضر 85 من 100% normal
saline، على الميزان بأوزن 85 من 100 جرام NaCl بحط
عليها 100 مل distilled water، طيب فيما لو كنت محتاجة إني
أحضر فيه ألف مل distilled water، بحط الألف تحت المية
وطرفين في وسطين وهيك بيصير عندي الـ weight للـ NACL
8.5 جرام، الـ daily wanted الثاني هو الـ peptone
الـ peptone هي البروتينات الصغيرة، النشأات من وين صار
في تكسير جزء للبروتينات، partial hydrolysis of
proteins، بتعطيني peptone، فهي الـ peptone بتكون عندي
على شكل powder، التركيز اللي راح يلزمني من الـ peptone
1 من 10%، كيف بدي أحضر 1 من 10% peptone؟ بقول لي على
الميزان بدي أوزن 1 من 10، 0.1 جرام من الـ
powder بحطها في flask وبحط عليها 100 مل distilled
water، طيب لو بدي أحضر في 1000 مل distilled water
طرفين في وسطين وبطلع معي الـ peptone 1 جرام، الـ
daily wanted third هو الـ peptone saline، هو عبارة عن
peptone زائد normal saline، طب كيف بدي أحضر الـ peptone
saline؟ بحط 0.1 جرام من الـ peptone، 85 من 100
جرام NaCl، والاتنين بحط عليهم 100 مل distilled water
بأخلط الـ 0.1 مع الـ 85 من 100 بحط عليهم
100 ml distilled water، قلت ليش بحتاج الـ diluent؟
لأن هي بتعملي تخفيف للـ analytical unit لحتى ما
يطلع معي to numerous to count، لما نرجع للجامعة إن
شاء الله بدّي نشتغل المعمل هذا على عينات الـ yogurt
أو اللبن السائل، بتجيني أو بدي أشتريها من الـ ..
من الـ supermarket، بتكون عندي علبة فيها 100 مل من
الـ yogurt، تمام، 100 مل هي .. هي بمثابة الـ sample
unit، لسه بدي أخد منها الـ analytical unit اللي هي
25 مل، بدنا إياها، قبل اللي أخد الـ 25 ml، قلنا لازم أضمن
هي تكون عينة ممثلة، يعني بدّي أعمل mix للـ Meat Meal
بعملها mix عادي برجها باستخدام تيب معقّم، بسحب 25 ml
من اللي جرت، بحطها في flask مغسول بالماء والصابون
والـ distilled water، أنا هيك صار عندي عينتي لسه
مركزة كده يعني بدي أخففها باستخدام Normal Saline
225 ml Normal Saline، قداش صار عندي التخفيف dilution
بيساوي الـ sample على الـ sample زائد الـ diluent
بيساوي 25 على 25 زائد 225، 1 إلى 10 أو 10 أس سالب 1
فهيك خففت العينة 1 إلى 10، بقول لي الأفضل نبدأ
بتخفيف 1 إلى 10، بغض النظر عن الكميات يعني قبل
شوية أنا هيني حضرت تخفيف 1 إلى 10 من خلال 25
sample، 225 من الـ diluent، بقدر كمان إنه أحضر
1 إلى 10 باستخدام 10 sample أو 90 من
الـ diluent، اللي هي بتصير 10 على 10 زائد، بقدر
كمان إنه أحضر 1 إلى 10 من خلال 11 sample و99 من
الـ diluent، فهي أول نقطة إنه بدي أبدأ بتخفيف 1
إلى 10، النقطة الثانية بيقول لي يفضل إنه أمشي
مضاعفات الـ 10، يعني أول شيء بعمل تخفيف 1 إلى 10
بعد هيك بعمل serial dilution، تخفيف 10 أس سالب
2 أو 1 إلى 100، 10 أس سالب 3 أو 1 إلى 1000 وهكذا
هكذا، شغلنا بيكون على شكل جروبات، لكل جروب عنده
أربع تيوبات، كل تيوب فيه 9 مل normal saline،
بدي أوحد الـ diluent وبدي أغيّر في محتوى
البكتيريا، فالـ diluent كلهم في كل التيوبات هتكون
عنده واحدة 9 مل، شو بدي أعمل؟ بدي أخد من الـ
flask 1 مل، بدي أحطه على التيوب الأول، التيوب
الأول بأخد منه 1 مل، بحطه على التيوب الثاني،
التيوب الثاني 1 مل على التيوب الثالث وعلى
الرابع، بالآخر فبسحب 1 مل من الرابع أو بكبّه
قلنا إنه للفلاسك تخفيفه 1 إلى 10 بأخد منه 1
مل بدي أحطه على أول التيوب، كيف بدي أخد الـ 1 مل
بأشيل السلفان عن الفلاسك بعقم الفوهة على اللهب
فبسحب 1 مل باستخدام تيب معقّم، بعقم الفوهة ثاني
أو بسكر بالسلفان، بروح على أول تيوب بافتح عنه
القطن سواب، بعقم، بحط فيه الـ 1 مل، بعقم ثاني و
بسكر، تمام، هيك قداش صار عندي الـ dilution في التيوب
الأول، التيوب الأول لحاله تخفيفه صار 1 مل حطينا
عليه، دي هي الـ sample و9 مل من الـ diluent، صار 1
على 9، صار 1 إلى 10، بس أنا هاي الـ 1 مل كنت ماخدها
من الـ flask لتخفيفه 1 إلى 10، معناته الـ total
dilution للتيوب رقم 1، تخفيفه في تخفيف التيوب اللي
قبله، 1 إلى 10 في 1 إلى 10، صار تخفيف للـ tube الأول 10
أس سالب 2، بالـ marker بكتب عليها 10 أس سالب 2، أنا
حطيت 1 مل، تمام، هل بينفع أخد الـ 1 مل مباشرة وأحطه
على الـ tube الثاني؟ طبعاً لا، لازم أعمل mix، بعمل mix
مظبوط باستخدام جهاز اسمه الـ vortex، بحطه على الـ
vortex، بيعمل mix للعينة، بعدين بروح أفتح الـ cotton
swab على الـ tube الأول، بعقم الفوهة، بأخد 1 مل
بعقم ثاني وبسكر، وبروح على الـ tube الثاني بحط
عليه الـ 1 مل، صار عندي الـ volume لـ أول الـ tube صار
فيه بس 9 مل، لأن أنا سحبت منه مل وأديته على الـ
tube الثاني، طيب، التيوب الثاني صار فيه 9 مل من الـ
Normal Saline و1 مل اللي أخدته من التيوب رقم 1،
يعني صار فيه 10 مل، قداش الـ Concentration أو الـ
Dilution، 1 على 9، 1 إلى 10، بس أنا هاي الـ 1
ماخده من التيوب، تخفيفه 10 أس سالب 2 أصلاً، فبالتالي تخفيف
التيوب الثاني في تخفيف التيوب اللي قبله، صار 1
إلى 10 في 1 إلى 100، صار تخفيفه 10 أس سالب 3
أو 1 إلى 1000، فبكتب عليه بالـ marker 1 إلى 1000، بعدين
بروح أخد 1 ml من الـ tube الثاني على الـ tube
الثالث، صار عند الـ volume في الـ tube الثاني صار فيه
شو؟ 9 ml، فبضطر أخد أخد 1 ml بديّه في آخر tube
حيصير عندي إنه 9 ml و1 ml جبناها من الـ
tube الثالث، شو بدي أعمل؟ بعمل mix وبعدين بتخلص من
1 ml، هاي اسمها الـ serial dilution، تخفيف أي
تيوب هو تخفيفه مضروب تخفيف التيوب اللي قبله، بعد
هيك من كل تخفيف بروح أخد 100 microliter أو 0.1
مل، هي هي وبزرعها على طبق فيه nutrient agar، بتكون
عندي الـ media solid متصلبة وجاهزة، باستخدام tip
معقّم، بأخد 100 micro من كل تيوب وبحطه على الطبق
لقباله، وبكتب بالـ marker 10 أس سالب 2، 10
أس سالب 3، 10 أس سالب 4، طبعاً بحطه في النص
الـ 100 microliter بحطه في النص، بعدين بروح أجيب ال
spreader أو الـ قلشاب، بعقمه كيف قلنا، بنعقم في
الكحول، وبعدين بمرره على اللهب، بحطه على عينتي، و
بقفرده على الطبق كمان
صار عندي أربع تخفيفات أو أربع تيوبات، كل تيوب فيه
له قبلات على التخفيف اللي له، طب احنا قلنا بنعمل
marker على الـ ... للتيوب على ظهره، بكتب عشرة أقصر
بتنين، عشر أقصر، بتلاتة، تمام، بقى بتركه شوية، بعد فترة
بقلبه بحيث أنه تكون الغطاية لتحت، inverted position
أو بسميها upside down، بقلبه وبحطه في الـ incubator
هو مقلوب، بخليه 24 hour على درجة حرارة 37، طيب ليش
بصبر عليها شوية؟ طب أنا كان بإمكاني أنه أزرع و
أقلبه مباشرة، لو قلبته على طول، فكل اللي أنا حاطيته
أو كل اللي زرعته هينزل تاني على الغطاء، ومعناته مش
راح يتكون عندي كلونيات خالص، احنا قلنا بدي نزرع
اليوم على الـ Nutrient Agar، طيب لو أنا كنت حابة أنه
أنمي نوع واحد من البكتيريا والآخر مثلا الـ staph
aureus، شو اللي راح يختلف عندي في التقنية بتاعت
اليوم؟ راح أعمل تخفيف للعينة عادي جدا باستخدام
Normal Saline، راح أعمل Serial Dilution عادي جدا
عادي جدا، لكن الاختلاف اللي هيكون فقط في الـ Media
في الوسط اللي راح أستخدمه، لإن بستخدم الـ Media حسب
نوع البكتيريا اللي بدي أنميها، فلو بدي أنمي جميع
أنواع البكتيريا، بستخدم General Media، ما فيش فيها
Inhibitors، لو بدي أنمي نوع معين من البكتيريا
بستخدم Media بحيث أنها تعمل Inhibition لأي نوع
ثاني، طيب، ممكن تجينا عينات لحمة، شو بدي أعمل فيها؟
أو كيف بدي أشتغل عينات اللحمة؟ أولا من ناحية الـ
Sample، you know، أنت بدي أخد من أكثر من مكان،
بعدين؟ بأحطها في الـ «blender» أو الـ «stomacher»
حتى أطحنها من solid إلى liquid، بحط عليها الـ
«diluent»، لكن إلا يعني ما تظل عندي جزيئات كثير
صغيرة، فباجي أزرع منها على الطبق، فبفكر هذه
الجزيئات إنها كولونيات، لكن هي بالأساس بتكون
particles من اللحمة، فهي بيسميها «interfering
particles»، شغلات ممكن تتدخل معي مع عد الكولونيات، كيف
بدي أتخلص منها؟ بقول لي عندي طريقتين لأتخلص من
الـ interfering particles، الطريقة الأولى أن ممكن أعمل
طبقين لكل تخفيف لـ tube، الأول بحط له طبقين، باخد 100
micro على أول طبق وبزرع، بعدين باخد كمان 100 micro
على الطبق الثاني وبزرع، هم الاثنين تخفيفهم عشرة
أضعاف بإثنين، لكن الاختلاف اللي يصير، في طبق بحطه في
الثلاجة أو طبق بحطه في الـ incubator، احنا عارفين
لو بدنا نمي البكتيريا ونوفر لها الظروف من ناحية
الحرارة، بدي أحطها في الـ incubator، لو حطيت الطبق
في الثلاجة، مش راح تنمو البكتيريا، في الطبق هذه
اللي في الثلاجة، لو لقيت أي شيء على الـ media،
معناته هذه، على الأكيد بدها تكون interfering
particles، لأن البكتيريا ما بتنمو في الثلاجة، تمام؟
فبروح بحدد مكان الـ interfering particles، حجمها،
عددها وبقارنهم مع الـ plate اللي كان في ال
incubator وبأطرحهم من بعض، الطريقة الثانية ممكن بعد
ما أزرع البكتيريا وأطلعها وأطلعها من الـ incubator
قبل اللي قاعد لسه، شو بعمل؟ بأضيف 2 مل من مادة اسمها
2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride، هي المادة
عندها القدرة إنها ترتبط بالبكتيريا وتلونها للون
أحمر، فباجي عندي هناك في الطبق، بتطلع اللي لونها
أحمر بدها تكون high colonies، فبعدها اللي مش ملونة
هي بدها تكون interfering particles، طيب شو سبب
اللون الأحمر اللي عندها؟ بقول لي الـ TTC تيجي
البكتيريا بتعمل لها reduction، اختزال، بتحولها إلى
مادة اسمها الـ Formazan وهي لونها أحمر، يعني الـ
TTC بيصير لها reduction بوسط البكتيريا بتتحول إلى
Formazan وهي لونها أحمر، لكن في مشكلة بتواجهني لما
أستخدم الـ TTC أنه ما بقدر أستخدم الـ colonies
المعادلة بالـ TTC for isolation and identification
of bacteria، لو عندي نوع بكتيريا وبدي أعرف شو هي
البكتيريا بالضبط، شو اسمها؟ ما بقدر أجري عليها ال
biochemical test، ما بنفع طول ما هي فيها TTC، ما
بنفعليش؟ لأن البكتيريا أو الـ colonies هتكون فقدت
بعضًا من خصائصها وبالتالي هتعطيني نتائج غير صحيحة
فمشان أشتغل الـ biochemical test أو ال
identification بشكل عام، لازم أنها تكون الـ colonies
fresh، مش معالجة خالص، يعني ما فيش عليها أي مادة، هيك
تقريبًا بنكون خلصنا المحاضرة، وحاليًا بدي نمشي على ال
slides، على السريع