Applicable to the enumeration of viable aerobic
bacteria in food الهدف من هذه الطريقة هي الطريقة
اللي هي من ال ACC الـ Aerobic Clinic Count أو
مسميها Total Viable Count الهدف منها enumeration
عد لبكتيريا بتكون حية و هوائية بتعتمد على وجود ال
oxygen في النمورح نعدها في ال food سواء كانت هي
البكتيريا psychrophilic إيش هي psychrophilic؟ محبة
لدرجات الحرارة اللي منخفضة أو محبة للبرودة
mesophilic محبة لدرجات الحرارة المعتدلة و
thermophilic محبة لدرجات الحرارة العاليةThe
Aerobic Colon Account الـ ACC استيمت بتقدر number
of viable aerobic bacteria سواء كانت بالجرام أو
بالملح حسب الحالة الفيزيائية لل product a portion
of the product بناخد جزء من العيلة اللي هي عبارة
عن ال analytical unit بعد نعمله سلسلة من التخفيفات
بروح أخد من كل تخفيف و بعملهis mixed with a
specified agar medium بروح أزرعه على الagar and
incubated under a specific condition of time and
temperature بحطه في ال incubator بوفر للبكتيريا ال
time و ال temperature حسب نوع البكتيريا اللي بديها
تنمو it's assumed that each viable aerobic
bacteria will multiply under these conditionsبقول
لي فبالتالي البكتيريا اللي كانت بالأساس ما بقدر
أشوفها بال naked eye لما و أفرلها الظروف هاي من
ناحية ال time و ال temperature راح يصير بإمكانها
multiplication تتضاعف بال binary vision و تنقسم
أكتر و تظهر على شكل visible كلني كلني بقدر أشوفها
بال naked eye و بالتالي بعدها which can be counted
الـ Cycrophilic bacteria هي المكتيريا المحبة
للبرودة which grows optimally at or below 15 which
has an upper limit أقصى درجة حرارة ممكن أنها تنمو
عليها هي 20 وأقل درجة حرارة has a lower limit of
growth 0يعني ده هي البكتيريا بتنمو على درجة حرارة
من 0 ل20 لكن أفضل نمو لإلها على درجة حرارة 15 ال
range من 0 ل20 و الأفضل على درجة حرارة 15 ال
metophilic bacteria an organism whose optimum
growth temperature أفضل نمو لإلها بتكون على درجة
حرارة 37 أو 30 لكنها بتنمو في ال range من 20 ل45
الـ Thermophilic Bakteria هي البكتيريا المحبة
للحرارة المرتفعة فبتقل المعدار الشعراء أكتر من 45
لكنها بتفضل الـ 55 هاي الشو في مواد ممكن نحتاجها
في المعمل راح نحتاج لـ Colonic Counting Device هذا
جهاز بعيد ال Colonies لكن إحنا في ما عملنا هنعيد
باستخدام الـ naked eye يعني إحنا مش بحاجة للجهاز
هذا لـ Stomacher أو لـ Blender جهاز بنستخدمه لطحن
الطعامبحوله من solid إلى liquid الـ pH meter بيعمل
على ضبط الـ pH الـ HCl و الـ NaOH هدول حمض و
القاعدة بيقوللي أول ما بيجيلي ال food بروح أقيس ال
pH لإله لو كان حامضي ال food لو كان حامضي بروح
أضيف عليه NaOH فبالتالي بضني أضيف أضيف لعند ما
يصير الوسط متعدل ال food متعدللو كان الـ Food
جييني قاعدي بضيف عليه HCl عند ما يتعادل طيب ليش
لازم أطبط الـ pH للـ Food؟ بقوللي في وسط اسمه الـ
MSA هاد هتاخدوه بالتفصيل في المعمل القادم ان شاء
الله MSA Media اسمها Manitol Salt Agar تمام؟ هاد
وسط خاص بنمي البكتيريا لـ Staph Aureus اسم الوسط
MSA
الـ Media هي من ضمن مكوناتها pH Indicator فالـ pH
اسمه Phenol Red لما الـ pH يكون حامضي بيعطيني لون
أصفر لو كان الـ pH alkaline أو قاعدي بيعطيني لون
أحمر تمام ال staff aureus راح تيجي وتنمو على هذا
الوسط اللي لونه بالأساس بيكون beigeطبعا البكتيريا
أثناء نموها بتستهلك من السكر الموجود في ال media
بتعمله fermentation بتطلع acid fermentation للسكر
بيعطي acid acid يعني pH منخفضة يعني هيصير الفينول
red أو ال pH هيكون acidic acidic هيعطي لون لون
أصفر ناتج عن شو ان البكتيريا عملت fermentation
فطلعت acidفمن اللون الأصفر بقدر أعرف أن هذه
البكتيريا بتطلع أسد طيب، فيه ملومات كنت عاملة تضبط
الـ pH للـ food وكان مثلا جاينة أنه عينت أنه مثلا
لبن و اللبن عدت، هاد حامضي فبالتالي الـ pH
Indicator هيتحسس لوجود الحمض اللي بالـ food و
هيطلع اللون أصفر إحنا هنفكر أن هذا الأصفر ناتج أن
فيه بكتيريا Staph aureus عملت fermentation للسكر
فطلعت أسد لكن لأ هي بالأسد جاية من الـ foodو هيك
هيعطيني رقم كيونيز أكتر من المتوقع حتى
لو كانت ناميا أي بكتيريا غير الـ Staph Aureus وهي
البكتيريا بطبيعتها ما بتعمل fermentation للسكر
فبالتالي هيطلع لون ال كيونيز لهذه البكتيريا أصفر
ليش؟ لأن فيه أسد أتي من الـ food فرح أعد هذه ال
كيونيز على أنها من ضمن ال Staph Aureus وهذا أساساً
خطأالبروسيجر تديرمين أي نوع من البكتيريا الرويكية
اللي بيستخدمها لازم أول اش نعرف شو نوع البكتيريا
اللي راح أنميها ليش؟ مش هنعرف شو نوع الوسط اللي
راح استخدمه فبوفر الوسط أو ال media حسب البكتيريا
اللي راح أنميها analyze each sample unit
individually كل عينة بتيجيلي بدي أتعامل معها بشكل
منفصلthe test shall be carried out in accordance
with the following instructions بدي أمشي على هاي
التعليمات handling of sample unit بالنسبة لها
التعامل مع ال sample unit هي اللي بناخدها من ال
lot during storage and transport أثناء عمليات
النقل والتخزين بدي أتبع الشغلات هاي أول أشي بقولي
أن العينة المتلجة بحافظ عليها متلجة من Zeroلأ
أربعة، العينة المتلجة بحافظ عليها متلجة و بخزّنها
درجة حرارة سالب عشرين لو .. لو بدي أشتغل حاليًا
على عينة frozen مجمدة، شو بعمل؟ بدي أعملها thawing
التسيح، يا إما بنزلها بالتلاجة من إتنين لخمسة لو
كنت مستعجلة عليها، بحطها في ال water bath درجة
حرارة أقل من خمسة و ربعين لمدة لا تزيد عن خمستاشر
minutesSample unit of a frozen product shall be
kept frozen Though frozen sample in a refrigerator
ممكن أحطها بالتلاجة بتسيح أو under time and
temperature أو تحت time و temperature معينين which
prevent microbial growth or deathدرج حر هيدا ال
water bath بأطبطها بحيث أنها ما بتعمل نمو أو قتل
لل micro organism فبتحافظ على العدد زي ما هو
analyze sample unit as soon as possible after
receipt in the laboratory بدي أحلل القي العين
بمجرد متصنيع المعملبالنسبة لتحضير ال media زي ما
عملنا في المعمل الماضي، بدنا نحضر ال media كيف؟
بأجيب أي media أني بديها مثلا للنيوتا يتأجر، بتطلع
على ال instructions من برا قداش بحتاج قلوات من ال
powder، قداش بحتاج عليها ل distilled water، بحطهم
مع بعض في ال flask، و بعدين بحطهم على ال hot
plate، إذا بحتاج لتعقيم، بحققهم بال Autoclave
تمام، بعد هيك بقصبهم and dispense in appropriate
quantities sterilizedبصوبهم في الأطباق قلنا بنصوب
من 15 ل 20 سم مكعب أو مليلتر A clean surface of
working area with a suitable disinfectant بديعقب
المنطقة اللي راح أشتغل عليها باستخدام disinfectant
اللي هو مادة بتعمل على قتل فقط الباثوجينيك بكتيريا
مش جميع أنواع الميكروعجنزم Clearly marked
deduplicate petribletsباستخدام ال marker راح أكتب
على كل طبق التخفيف لإله بقول لي ممكن نستخدم
duplicate لكل تخفيف مثلا لل tube الأول كان تخفيفه
عشرة أساليب اتنين بقدر استخدمله هاد طبقين الطبق
الأول بحط عليه 100 micro الطبق التاني 100 micro
أما الأتنين بحطهم في ال incubator بعد 24 ساعةبعد
الـ QnA في الأتنين و باخد الـ average لإلهم لو
كانت واقعة ضمن ال range من 25 ل 250 بعوض في
القانون ال concentration بيساوي أنا على SVD أو
ممكن أعمل duplicate لكل تخفيف واحد بحطه بالتلاجة
والتاني بحطه بال incubator ليش هاي؟ مش هي ال
interfering particlesأو اللي احنا بدي نمشي عليها
بس بعمل طبق واحد لكل تخفيف بحطه في الـ incubator و
بعد الكيلونز لو كانت واقعة ضمن ال range بعوض في
القانون بالنسبة لـ dilution preparation of
dilutions هم بيحكيني بدي نحضر واحد و عشرة بيبتون
water diluent لكن احنا راح نشتغل عليها في ما عملنا
normal saline 85 من 100% بقول لي to ensure truly
مشان أضمن أنه أخد تعيين ممثل من ال analytical unit
لازم أعمل agitation لل sample unit until the
content are homogeneous لو كانت solid بحطها في ال
blender لو كانت liquid بعملها mixIf the sample
unit is solid لو كانت ال sample unit عندي solid زي
مثلا طحين، لحمة، سلطة، شو بعمل؟ obtain the
analytical unit by taking a portion from several
locations within the sample unit راح أخد من كل
مكان، من فوق، من تحت، من الوسط، من الأطراف بيقول
لي prepare واحد لعشرة dilutions of food كيف بقدر
أحضر واحد لعشرة؟ممكن باستخدام 25 إجرام من السمبل و
225 مل من الـ Diluent أو ممكن11 جرام من الـ Sample
و 99 مل من الدولوينت أو 10 جرام Sample و 90 مل من
الدولوينت بغض النظر عن الكيميات بقدر أحضر تخفيف 1
ل 10 ال slide اللي بعده هاي مش مهمة لكن المقصود
فيها إن إحنا بدأ نبدأ بتخفيف 1 ل 10 و بدنا نمشي
على مضاعفة العشرة 1 ل 10 1 ل 100 1 ل 1000 و هكذا
Check the pH of the food suspension بيقول لي لازم
أنه انحافظ على الـ pH للـ food بحيث انها تكون
واقعة من خمس و نص لسبعة point ستةطيب لو كان الـ pH
للفوض لما قصته بالـ pH Meter كان عندي مثلا أربعة
أربعة يعني هاتش مالها acidic بدي أضيف عليها NaOH
بضن أضيف لعند ما يصل عندي ل ال range الموجود هذا
هو ال range بحيث أنه يكون فيه الفوض متعادل لو كان
عندي الفوض الـ pH لإله تمانية شو بعمل؟ بضيف HCl
بحيث أنه ينزل الـ pH للفوض و يصير ضمن ال range
prepare succeeding decimal delution يعني بدي أعمل
سيريال دي لوشن كذا تخفيف as required using a
separate sterile pipet for making H-transfer رح
أستخدم بيبت و أستخدم معاه تب امعقم و رح أاخد من كل
تيوب واحد مل للتيوب اللي بعده mix واحد مل و هكذا
Shake all dilutions immediately prior to making a
transfer يعني أنا كنت عمال بشتغل على أول تيوب
فعملتله mix روحت أخدت منه واحد مل و بعدين للتيوب
التاني واحد مل و هكذا فطولت أنا هيك على التيوب
الأول بدي أجي حاليا أخد 100 micro من أول تخفيف
أحطه على الطبق طبعا أنا أستنيت عليها فترة لعين ما
أخلص باقي ال tubes معناه للكلام أنه البكتيريا نسلت
تحتصار عندى التوزيع مش متساوي فلازم أعمل vortex
كمان مرة، mix بعمل mix و بعدين باخد 100 micro و
بأزرع على الطبق ليش؟ to ensure uniform
distribution of the microorganism present الشكل
هذا بيقولك كيف لما يكون في عندى أكتر من تخفيف مثلا
1 ل10، 1 ل100، 1 ل1000، شو بعمل؟ باخد 100
microliter من كل .. من كل اتيوب بحطه على الطبق
بزرعه بستنى عليه شوية بعدين بقلبه inverted
position upside down بعدين بحطه في ال incubator 24
ساعة لمدة على .. على 37 بعد الكولونز لاحظوا أن أول
اتيوبين كان عندى الكولونز كتير كبيرة مليانةبدي أجي
عدها هلاحظ أنه عددها already أكثر من 250 فالنتيجة
إليهم هتكون too numerous to count ما بقدر أستخدم
القانون عليهم الـ 2 بالتالت لما عدوها 65 هي واقعة
ضمن ال range من 25 إلى 250 وبالتالي بقدر أعوض في
القانون الـ 4 والخامس 6 colonists و 0 هدولبنسميهم
negative أو too few to count، TFTC ما بقدر أعوض في
القانون بدي أزرح حاليا ل plating يعني بدي أاخد من
ال tube و أحط على الطبق agitate each dilution
bottle to resuspend material that may have settled
out during preparation برضه بروح أحط على ال vortex
تانيلحتى أخد الميت مايكرو و أحطها على البلاد لحتى
يصير uniform distribution of microorganismشو بعمل
بعد هي خلاص فزراعت بحطهم في ال incubator لكن
inverted position مقلبين الغطايا بدها تكون للأسفل
Incubation temperature is dependent on the growth
temperature requirement of the target organism
بيقوللي درجة الحرارة وال time أنا بتحكم فيهم
بأفبطهم حسب نوع البكتيريا اللي بدي أنامي هل هي
psychrophilic محب لدرجة حرارة انما خفضة mesophilic
معتادلة thermophilic عاليةavoid a crowding or
excessive stacking of bloods بدي أمنع أن يكون عندي
الأطباق فوق بعض بشكل كبير أو يكون في عندي أزدحام
في ال incubator ليش؟ لأن هذا الأشي مش راح يسمح أنه
بتوزيع منتظم للحرارة على كل الأطباق فبدي أراعي أنه
ما تكون الأطباق مسفتة فوق بعض وأكتر من ال tubes
أكتر من ال bloodsبالنسبة اللي اعد ال colonies
count colonies promptly after the incubation بيجد
okay انه هي البكتيري بتحتاج 24 ساعة خلاص خلصت ال
24 ساعة مباشرة بروح بعد ال colonies ما بسمح بوقت
إضافي if possible select plants with من 25 ل250
colonies حتى بما فيها يعني ال colonies اللي بتكون
pinpoint اللي صغيرة كتير زي رأس الدبوس هاي برضه
كمان بعدهاإيه في بلايات contain colonies which
spread؟ بقولي لو كان عندى الطبق فيه colonies موزع
بالتساوي أو بانتظام على طول الطبق يعني مش أن يكون
في عندى فيه جهةامكدس فيها الكولونز جهتاني وفاضلة
لو كانت الكولونز موزعة بالتساوي و بانتظام في جميع
الطبق شو بعمل Select representative portion of the
plates free from spreader if possible and count
the kolones in this area بقى شوف بقسم الكل .. بقسم
البلات عندى الى أربع أربع باخد بس ربع واحد بعيد
قدش فيه kolones وبالتالي بقدره في أربع و هيك بصير
زي كإني عديت ال kolones اللى فى الطبق ككلThe total
count of the entire plant is estimated by شو بعمل
multiplying the count بدي أضرب قداش عندي العدد في
المنطقة اللي أنا عديتها في أربعة ع سبيل المثال
بقولي لو طلع منك لو طلع بس تلاتين كيلو نص في ربع
واحد بدي في كل الطبق تلاتين في أربعة بطلع مية
وعشرين كيلو نص العدد هاد واقع ضمن ال range
وبالتالي بطبق القانونdifferentiation of colonies
from interfering particles كيف بدي أميز هل هاي
اللي عندى colonies أو هل هى interfering particles
بقول ليه ال food particles أو ال interfering
particles زى مثلا اللحمة لما ضال في منها جزيقات مش
دائبة أو مثلا ال milk powder البودرة often
interfere with the enumeration of the blood هيصير
فيه تداخل أو في لبس بين عدالـKidneys وعد
الـinterfering particles الكفة دي أتخلص منها عن
طريق by making one extra plate of each dilution
لكل تخفيف بحطله كمان طبق تاني وهذا الطبق تاني قلنا
بحطه في التلاجة كcontrol بشوف قداش طالع عندي شكل
قداش طالع عندي عدد الـinterfering particles وشكلها
وموقعها و بقارنها مع موقعها اللي في الطبق اللي في
ال incubatorAlternatively ممكن طريقة تانية After
incubation بعد ما أطلع الطبق من ال incubator بدي
أجي أعد شو بعمل؟ قبل اللي أعد بحط 2 مل TTC
Triphenyl Tetrazolium Chloride المادة ده هي بحط
منها 2 مل على الطبق ككل و بوزحها على الطبقGently
روك بلات from side to side يعني بدي أحرك الطبق
لحتى إنه هاي المادة تتوزع على كل الطبق اللي عندي
بعد هيك بخليها على ال room temperature لمدة 3
ساعات حطيتها okay بحطها على ال room temperature و
بقلبها بعد كده بدي أطلع على لون ال colonies لو كان
لو كان لونها أحمر معناته هاي colony أو إنها
بكتيريا لو ماتلون معناته interfering particleأيش
بيخليها تتلون أن البكتيريا بتعمل reduction للـ TTC
بتحوليها لحاجة اسمها Formazan وهذه اللي لونها أحمر
فبالتاليand aids in distinguishing the food
particles هتساعد إنها تتميز ال food particles عن
ال kidneys لكن قلنا المشكلة اللي بتواجهني kidneys
cannot be picked for isolation after this method
has been used ما بقدر أستخدم ال kidneys هاي اللي
تم معالجتها بال TTC لإنها هتفقد بعض من خواصها وما
راح تعطيني نتائج صحيحة recording result طبعا هدول
لما نرجع شاء الله على الجامعة هنعمل التقاريرشو
بعمل؟ لو أنا مستخدمة طبقين لكل تخفيف والاتنين في
الـ incubator بروح أعد الكودنس في الأتنين و باخد
الـ average لإلهم بعوت في القانون لو كان العدد
واقع ضمن الـ range الـ concentration بسوء N على S
في دي الـ N هي ال number of kudones الـ S هي ال
volume اللي اتت دي، لازم تكون بالمل و هو ال volume
اللي أخدته من التيوب و حطيته على البلاد و الـ D هو
ال dilution الخاص لكل تيوب