نبدأ اليوم إن شاء الله بالمعمل الرابع بعنوان
Arabic Colonic Count بنرمزله ACC أو إلها مصطلح
تاني Total Viable Count لاحظوا أنا عمالي بأحكي
كلمة Count معناته فيها عد الشغلة، فيها عد معناته
هي من ضمن ال food analysis اللي هي ال quantitative
مش qualitativeTotal يعني عد جميع أنواع البكتيريا
بغض النظر عن نوحها طيب بدي أعد الكل يعني ال media
مش هيكون فيها أي inhibitors فهي ال media بيسميها
general media مثال عليها للـ nutrient agar viable
يعني بكتيريا حية بكتيريا حية لإن هذه هي اللي هتكون
عندها القدرة إنها تلم و تتكثر أو تتضاعف في ال size
وسيلها multiplication وتزهل بالنهاية على شكل
كولونيهنبدأ بملخص للمعمل وبعدين هنمشي على الـ
سليدات حكينا إنه في عند الـ sample line خط إنتاج
لكل خط إنتاج له lot والـ lot له lot number قلنا من
العجنة أو من الـ lot باخد حاجة اسمها الـ sample
unit الـ sample unit على الأقل بتكون 100 جرام أو
مل ليش 100 على الأقل هيتعتبر statistical
significantمن الـ Sample Unit باخد منه مقدار من 25
لـ 50 جرام أو مل سميناها الـ Analytical Unit وهي
هي اللي بشتر عليها في المعمل اليوم بدنا نعدّي
البكتيريا الموجودة في أي عينة ممكن تصلنافبحكيلي
بمجرد متجيني العينة يستحسن نعملها dilution نعمل
تخفيف ليش بدعمل تخفيف للعينة مش أنه أخد العين
مباشرة و أزرحها لأنه ممكن لو أخدت مباشرة أو زرعتها
هيكون عندي عدد الكلنز كتير كبير عندي في الطبق
الصعب أنه أنا أعدهفإيه الجواب؟ to dilute bacteria
in the sample مشان أخفف البكتيريا في العينات هي
واحد الشغلة التانية to avoid saying لحتى ما يطلع
معي النتيجة to numerous to count TNTC لو طلع العدد
صعب جدا أنه أنا أعد أكتر من 250 كيلون في الطبق
بسميها to numerous to countطيب أنا قولت بدي أخفف
العينة بمجرد ما تصلني بدي أخففها معناته بحتاج إلى
diluent شغلات بخفف فيها عندي تلات أنواع لـ diluent
أول إشي الـ normal saline وهذا بدنا نستخدمه بشكل
كبير في ما عملنا normal saline هو ملح طعام مع
distilled water هي هيكو بس محلول ملح اسمهالتركيز
اللي بلزمنيه 85 من 100% لاحظوا أنه هذه التركيز ما
بعمل shrinking أو swallowing للبكتيريا ما بيخليها
تتقلص أو أنها تنتفخ كيف بدي أحضر 85 من 100% normal
saline على الميزان بأوزن 85 من 100 إجرام NaCl بحط
عليها 100 مل دستيل بوتر طيب فيما لو كنت محتاجةإني
أحضر فيه ألف مل دسترد واتر بحط الألف تحت المية
وطرفين في وسطين و هيك بيصير عندي ال weight لل NACL
تمانية و نص جرام ال daily wanted تاني هو البيبتون
البيبتون هي البروتينات الصغيرةالنشأات من وين صار
في تكسير جزء للبروتينات partial hydrolysis of
proteins بتعطيني بيبتون فهي البيبتون بتكون عندي
على شكل powder التركيز اللي راح يلزمني من البيبتون
1 من 10%كيف بدي أحضر 1 من 10% بيبتون بقوللي على
الميزان بدي أوزن 1 من 10 1 من 10 اجرام من ال
powder بحطها في flask و بحط عليها 100 مل distilled
water طيب لو بدي أحضر في 1000 مل distilled water
طرفين في وسطين و بطلع معي البيبتون 1 اجرام ال
daily wanted diet هو البيبتون salineهو عبارة عن
بيبتون زائد normal saline طب كيف بدي أحضر البيبتون
saline؟ بحط 1 من 10 اجرام من البيبتون 85 من 100
جرام NACL والاتنين بحط عليهم 100 مل ديستلت ووتر
بأخلط الواحد من عشرة مع الـ 85 من 100 بحط عليهم
100 ml distilled water قلت ليش بحتاج الـ diluent؟
لإن هاي بتعملي تخفيف للـ analytical unit لحتى ما
يطلع معي two numerous to count لما نرجع للجامعة ان
شاء الله بدى نشتغل المعمل هاد على عينات ال yogurt
أو اللبن السائلفابتجيني أو بدي أشتريها من الـ ..
من الـ supermarket بتكوني عندي علبة فيها 100 مل من
الـ yogurt تمام 100 مل هي .. هي بمثابة ال sample
unit لسه بدي أخد منها ال analytical unit اللي هي
25 مل بدناياهاقبل اللي أخد الـ 25ML قلنا لازم أضمن
هي تكون عينة ممثلة يعني بيدعمل mix ل الـ Meat Meal
بعملها mix عادي برجها باستخدام تيب معقن باسحب 25ML
من اللي جرت بحطها في flask مغسول بالمي و بالصابون
و بالـ distilled water أنا هيك صار عندي عينتي لسه
امركزة كده يعني بدي أخففها باستخدم Normal Saline
225MLNormal Saline قداش صار عندي التخفيف Delution
بيساوي ال sample على ال sample زائد ال diluent
بيساوي 25 على 25 زائد 225 1 إلى 10 أو 10 أسالب 1
فهيك خففت العينة واحد لعشرة بقول لي الأفضل نبدأ
بتخفيف واحد لعشرة بغض النظر عن الكميات يعني قبل
شوية أنا هيني حضرت تخفيف واحد لعشرة من خلال خمس
وعشرين sample 225 من الدوليوانت بقدر كمان أنه أحضر
واحد لعشرة باستخدام عشرة sample أو 90 من
الدوليوانت اللي هي بتصير عشرة على عشرة زائدبقدر
كمان أنه أحضر واحد لعشرة من خلال 11 sample و 99 من
ال diligent فهي أول نقطة أنه بدي أبدأ بتخفيف واحد
لعشرة النقطة التانية بيقول لي يفضل أنه أمشي
مضاعفات العشرة يعني أول إشي بعمل تخفيف واحد لعشرة
بعد هيك بعمل serial dilution تخفيف عشرة أسالب
اتنين أو واحد لمية عشر أسالب تلاتة أو واحد لألف و
هكذافشغلنا بيكون على شكل جروبات، لكل جروب عنده
أربع تيوبات، كل تيوب فيه تسعة مل normal saline،
بدي أوحد الـ diluent و بدي أغير في محتوى
البكتيريا، فالـ diluent كلهم في كل التيوبات هتكون
عنده واحدةتسعة مل، شو بدي أعمل؟ بدي أخد من ال
flask واحد مل، بدي أحطه على التيوب الأول، التيوب
الأول باخد منه واحد مل، بحطه على التيوب التاني،
التيوب التاني واحد مل على التيوب التالت وعلى
الرابع، بالآخر فبسحب واحد مل من الرابع أو بكبه
قلنا إنه لفلاسك تخفيفه واحد لعشرة بيداخد منه واحد
مل بدي أحطه على أول التيوب كيف بدي أخد الواحد مل
بأشيل السلفان عن لفلاسك بعقّم الفوهة على اللهب
فبسحب واحد مل باستخدام تب امعقّم بعقّم الفوهة تاني
أو بسكر بالسلفان بروح على أول تيوب بافتح عنه
الكوتون اسواب بعقّم بحط فيه الواحد مل بعقّم تاني و
بسكرتمام، هيك قداش صار عندى الـ dilution في التيوب
الأول التيوب الأول لحاله تخفيفه صار 1ml حطينا
عليها دي هي ال sample و 9ml من ال diluent صار 1
على 1 زي 9 صار 1 ل 10 بس أنا هاي ال 1ml كنت ماخدها
من ال flask لتخفيفه 1 ل 10 معناته ال total
dilution للتيوب رقم 1 تخفيفه في تخفيف التيوب اللى
قبله1 ل 10 في 1 ل 10 صار تخفيف للـ tube الأول 10
والسالب 2 بال marker بكتب عليها 10 والسالب 2 أنا
حطيت 1 مل تمام هل بينفع أخد ال 1 مل مباشرة و أحطه
على ال tube التاني طبعا لأ لازم أعمل mix بعمل mix
مظبوط باستخدام جهاز اسمه ال vortex بحطه على ال
vortexبيعمل mix للعينة بعدين بروح أفتح ال cotton
swab على ال tube الأول بعقم الفوها باخد واحد مل
بعقم تاني و بسكل و بروح على ال tube التاني بحط
عليه الواحد مل صار عندي ال volume لأول ال tube صار
فيه بس 9 مل لأن أنا سحبت منه مل و أديته على ال
tube التانيطيب، التيوب التاني صار في 9 مل من الـ
Normal Saline و 1 مل اللي أخدته من التيوب رقم 1،
يعني صار فيه 10 مل قداش الـ Concentration أو الـ
Dilution، 1 على 1 زي 9، 1 لـ 10، بس أنا هاي الـ 1
ماخده من التيوب، تخفيفه 10، أصلا بـ 2، فبدرب تخفيف
التيوب التاني في تخفيف التيوب اللي قبلهصار واحد
لعشرة في واحد لمية صار تخفيفه عشرة و أسالب تلاتة
أو واحد لألف فبكتب عليه بال marker واحد لألف بعدين
بروح أخد واحد mil من ال tube التاني على ال tube
التالت صار عند ال volume في ال tube التاني صار فيه
شو تسعة mil فبضني أخد أخد واحد mil بودّي فأخر tube
حيصري عندي أنه تسعة mil و واحد mil جيبناها من ال
tube التالت شو بدي أعمل؟ بعمل mix و بعدين بتخلص من
واحد mil هاي اسمها الـ cereal dilutionتخفيف أي
تيوب هو تخفيفه مضروف تخفيف التيوب اللي قبله بعد
هيك من كل تخفيف بروح أخد 100 microliter أو 1 من 10
مل هي هي و بزرعه على طبق فيه nutrient agar بتكون
عندي ال media solid متصلبة وجاهزة بستخدام tip
امعقم باخد 100 micro من كل تيوب و بحطه على الطبق
لقبالهوبكتب بالـ Marker عشرة أقسار باتنين، عشرة
أقسار بتلاتة، عشرة أقسار باربعة طبعا بحطه في النص
ال mid microliter بحطه في النص، بعدين بروح أجيب ال
spreader أو القلشاب، بعقمه كيف قلنا، بنعقم في
الكحول، و بعدين بمرره على اللهب، بحطه على عينتي، و
بقفرده على الطبق كمان
صار عندى أربع تخفيفات أو أربع اتيوبات كل تيوب فيه
له قبلات عليا التخفيف لإله طب احنا قلنا بنعمل
marker على ال .. للتيوب على دهره بكتب عشر أقصر
بتنين عشر أقصر بتلاتة تمام بقى تركه شوية بعد فترة
بقلبه بحيث أنه تكون الغطاية لتحت inverted position
أو بسميها upside down بقلبه و بحطه في ال incubator
هو مقلوببخلّيه 24 hour على درجة حالة 37 طيب ليش
بصبر عليها شوية؟ طب أنا كان بإمكاني أنه أزرع و
أقلبه مباشرة لو قلبته على طول فكل اللي أنا حاطيته
أو كل اللي زرعته هينزل تاني على الغطاء ومعناته مش
راح يتكون عندى كل الناس خالص إحنا قولنا بدي نزرع
اليوم على الـNutrient Agar طيب لو أنا كنت حابة أنه
أنمي بصنع واحد من البكتيريا والآخر مثلا الـstaph
aureusشو اللي راح يختلف عندى فى التقنية بتاعت
اليوم راح أعمل تخفيف للعينة عادي جدا باستخدام
Normal Saline راح أعمل Serial Dilution عادي جدا
عادي جدالكن الإختلاف اللي هيكون فقط في الـ Media
في الوسط اللي راح أستخدمه لإن بستخدم الـ Media حسب
نوع البكتيريا اللي بدي أنميها فلو بدي أنمي جميع
نوع البكتيريا بستخدم General Media مافيش فيها
Inhibitors لو بدي أنمي نوع معيّن من البكتيريا
بستخدم Media بحيث أنها تعمل Inhibition لأي نوع
تاني طيب، ممكن تجينا عينات لحمة، شو بدي أعمل فيها؟
أو كيف بدي أشتغل عينات اللحمة؟ أولا من ناحية الـ
Sample، you know أنت بدي أخد من أكتر من مكان،
بعدين؟بأحطها في الـ «blender» أو الـ «stomacher»
حتى أطحنها من solid إلى liquid بحط عليها الـ
«diluent» لكن إلا يعني ما تظل عندي جزيئات كتير
صغيرة فباجعت أزرع منها على الطبق فبفكر هذه
الجزيئات إنها كولونز لكن هي بالأساس بتكون
particles من اللحمة فهي بيسميها «interfering
particles» شغلات ممكن تتدخل معي مع عد الكولونزكيف
بدي أتخلص منها؟ بقوللي عندي طريقتين لأتخلص من
الـinterfering particles الشغل الأولى أن ممكن أعمل
طبقين لكل تخفيف لـ tube الأول بحطله طبقين باخد 100
micro على أول طبق وبزرع بعدين باخد كمان 100 micro
على الطبق التاني وبزرع هم الأتنين تخفيفهم عشرة
أسالة بإتنينلكن الإختلاف اللي يصير في طبق بحطه في
التلاجة أو طبق بحطه في الـ incubator إحنا عارفين
لو بدنا نمي البكتيريا و نوفلها الظروف من ناحية
الحرارة، بدي أحطها في الـ incubator لو حطيت الطبق
في التلاجة، مش روح تنمو البكتيريا، في الطبق هذي
اللي في التلاجة، لو لقيت أي إشي على الـ media،
معناته هاي، على الأكيد بديها تكون interfering
particles لأن البكتيريا ما بتنمو في التلاجة، تمام؟
فبروح بحدد مكان الـ interfering particles حجمها،
عددها و بقارنهم مع الـ plate اللي كان في ال
incubator و باطرحهم من بعض الشغل التاني ممكن بعد
ما أزرع البكتيريا و أطلمه و أطلحها من ال incubator
قبل اللي قاعد لسه شو بعمل بأضيف 2 مل من مادة اسمة
TTCTry Phenyl Tetrazolium Chloride هي المادة
عندها القدرة إنها ترتبط بالبكتيريا وتلونها للون
أحمر فباجي عندي هناك في الطبق بتطلع اللي لونها
أحمر بدها تكون high colonase فبعدها اللي مش ملونة
هي بدها تكون interfering particles طيب شو سبب
اللون الأحمر اللي عنده؟بقول لي الـ TTC تيجي
البكتيريا بتعملها reduction اختزال بتحولها إلى
مادة اسمها الـ Formazan وهي اللونها أحمر يعني الـ
TTC بيصيرها reduction بوسط البكتيريا بتتحول إلى
Formazan وهي اللونها أحمرلكن في مشكلة بتواجهني لما
أستخدم الـ TTC أنه ما بقدر أستخدم الـ colonies
المعدلة بالـ TTC for isolation and identification
of bacteria لو عندي نوع بكتيريا و بدي أعرف شو هي
البكتيريا بالظبط، شو اسمها؟ ما بقدر أجري عليها ال
biochemical test، ما بنفع طول ما هي فيها TTC، ما
بنفعليش؟ لأن البكتيريا أو الـ colonies هتكون فقدت
بعضا من خصائصها وبالتالي هتعطيني نتائج غير صحيحة
فمشان أشتغل ال biochemical test أو ال
identification بشكل عام لازم أنها تكون ال colonies
fresh مش معالجة خالص يعني مافيش عليها أي مادة هيك
تقريبا بنكون خلصت المعمر وحاليا بدي نمشي على ال
slides ع السريع