هم رحمة الله وبركاته اللي بنعمل التاسع بعنوان
isolation of Escherichia coli O157:H7 in foods
لاحظوا احنا بنحكي isolation ما حكينا enumeration
مابدنا نعد، ليش؟ لأنه ال Escherichia coli لو كان
موجود كل واحدة منها بالfood بيكون ال food غير صالح
لل human consumption معناته العدد ما بيهمني على قد
ما بيهمني هل موجود إشريشيا كولاي O157:H7 أو لأ طيب،
شو هما الـ O و الـ H اللي باسم البكتيريا؟ هدول
الإتنين يعتبروا Antigens الـ O هو Somatic Antigen
و الـ H هو Flagellar Antigen فلاجلر معناته البكتيريا
عندها فلاجلة بتستخدمها البكتيريا للحركة يعني
الشريشة كولاي O157:H7 تعتبر motile
بالنسبة لـ الـ Objective هنعمل detection للإشريش
كولاي O157:H7 in food هنتعرف على الـ pathogenic
strains بناء على الـ biochemical و الـ
physiological characteristics للبكتيريا كمان هيكون
في rapid testing زي مثلا immunochromatographic
technique بتأكد من خلالها على وجود الإشريشيا كولاي
O157:H7 بالاعتماد على مبدأ antigen antibody
reaction الشريشة كولاي O157:H7 is an important
foodborne pathogen، food بنتقل عن طريق الفئة
بكتيريا تنتقل عن طريق الـ food causing symptoms
تعمل أعراض بتتراوح بين ميال ديارية لهيموروجيا
كولايزي اللي هو بيكون في نزيف في القولون بالإضافة
لهيموروجيا كيوراميكا سندروم Most outbreaks and
sporadic cases have been associated with
consumption إيش الأسباب ممكن تعمل في إمراضية
بالإشريشيا كولاي؟ وين ممكن تكون موجودة؟لو أنه تم
تناول food undercooked، غير مطهي بشكل منيح، خاصة
اللحم البقري، وبرضه كمان dairy product منتجات
الألبان زي الـmilk untreated، يعني مصل ومعالجة،
يعني الحليب الغير مبستر Infections due to
Escherichia coli O157:H7 لحظة يكون في
المكتوب Escherichia coli O157:H7 عرفوها تلقائيا at
seven إلا لو كنت أنا معنية أن تكون نوع آخر فبكتب
Escherichia coli O157:H7 not at seven are increasing
أن العدوى بالبكتيريا هيبتزداد ومتواجدة في wide
ranges of food زي مثلا Under cooked meat اللحوم غير
مطهية بشكل جيد، ال vegetables، الخضروات، السلطات
الخضار، ال coleslaw اللي هي سلطات الكرنب كمان acid
-based food زي القبل cider المقصود فيها عصير
التفاح الليغارد اللبن ال sausages اللي هي النقانق
microbiological guidelines for ready to eat food
الـ Standard تحكي مشان يكون الطعام جاهز أنه ناكله
صالح للهيوم الـ consumption فالمفترض بالناحية
الاشريشيا هيكون اللهي O157:H7 يكون عدد البكتيريا
Zero لإن كدنيا واحدة بتعمل disease، ان خمس وعشرين
جرام خمسة و عشرين جرام هاي اللي هي ال analytical
units هو خمسة و عشرين جرام أو خمسة و عشرين مل لازم
لما نيجي نفحصها في المختبر لحتى نحكي هذا ال food
صالح لل human consumption لازم مايكون في الشريشة
كولاي O157:H7 خالص most strains of
الشريشة كولاي O157:H7 don't ferment sorbitol طيب
قبل اللي نحكي عن ال sorbitol لو سألت شو هم الـ
characteristics لـ Escherichia coli O157:H7 نكون
عارفين أن Escherichia coli O157:H7 هي من ضمن الـ
Escherichia coli العادية يعني هي من ضمن الـ Total
Coliform زي ما احنا عارفين كمان من ناحية المخطط
اللي أنا كنت عاملة حكيت في عقلات
Enterobacteriaceae هذه تعتبر الـ Gram Negative بصي
الغرام قسموا الأوردنزم اللي فيها حسب اللاكتوز
لاكتوز فرمنتر ونون لاكتوز فرمنتر وكانت توتر كولي
و4 من ضمن اللاكتوز فرمنتر نشي على خصائص
الإشريشيا كولاي O157:H7 أول حاجة Gram Negative بعدين
باصي الغرام من ناحية اللاكتوز فهي لاكتوز فرمنتر طيب
لما بعمل fermentation لسكر اللاكتوز بطلع منه
produce acid with gas لإتنين كمان هي facultative
and aerobic بكتيريا وقولت قبل شوية إنها بتكون
foodborne pathogen كمان عندها flagella معناته هي
motile طيب لو بدي أميز البكتيريا الإشريشيا كولاي عن
الإشريشيا كولاي O157:H7 هل بينفع أستخدم ميديا
المكونكي أجار المكونكي أجار معروف أنه فيها
سكر اللاكتوز طيب، هل سكر اللاكتوز من خلاله بقدر
أنه أنا أميز الإشريشيا كولاي عن الإشريشيا كولاي
O157:H7؟ الجواب لأ، ليش؟ لأن هما الأثنين بيعملوا
fermentation لسكر اللاكتوز، معناته ما بتقدر أنها
تساعد في التفرقة بين البكتيريات طيب، شو حكوا؟ شو
عملوا؟ راحوا عدلوا في ميديا المكونكي حكوا بدل ما
فيها سكر اللاكتوز اللي مابيفيدني في التفريقة بروح
أستخدم سكر تاني هو سكر السوربيتول صار اسم ال media
سوربيتول ميكونكي بنحكي عنها اسمها سوربيتول ميكونكي
ولاحظوا أن الإشريشيا كولاي O157:H7 ما بتعمل
fermentation لسكر السوربيتول أما الإشريشيا كولاي
بتعمل fermentation لسكر السوربيتول طيب المكونكي سواء
العادية أو السوربيتول فيها الـ pH indicator هو هو نفسه
اسمه الـ neutral red البكتيريا لما بتعمل
fermentation لأي سكر بتطلع منها acid ال acid بتقلل
ال pH بيحول لون ال media إلى لون pink to red تمام
فالاشريشيا كولاي سواء بالمكونكي أو بالسوربيتول مكونكي
هي أكيد هتعمل fermentation للنوعين سواء
لكتوز أو سوربيتول هيكون اللون pink to red
طيب الشريشة كولاي O157:H7 ما بتعمل fermentation
لسكر السوربيتول ما بتعمل fermentation يعني ال pH
هيكون basic يعني اللون هيكون colorless لما يكون
colorless معناته هاي ميديا الشريشة كولاي O157:H7
طيب الشريشة كولاي O157:H7 على الميديا المكونكي هيكون
لونها pink to red لإنها بتعمل fermentation لسكر ال
lactose لكن على السوربيتول لونها هيكون colorless لإنها
ما بتعمل fermentation للـ Sorbitol فاحنا بدنا
نعزل اللي هيكون لونها colorless على ميديا السوربيتول
نرجع تاني معظم السلالات الإشريشيا كولاي O157:H7 don't
ferment sorbitol within 24 hours بقدر أن أستخدمها
لتعريف عن non-sorbitol fermenter و أضيف على ال
characteristics للإشريشيا كولاي O157:H7 كمان بقدر أضيف
إنها Beta-Glucuronidase Negative يعني ما عندها
إنزيم لـ Glucuronidase وين مارى علينا هذا الإنزيم؟
مارى علينا لما نحكي عن الـMUG لما يكون في عندى
عينة water بحط عليها الـreagent تبعي اللي هو
الـMUG وبقى أشوف لو البكتيريا عندها Glucuronidase
هيكسر الـMUG ولما أعرضها لـUV هيطلع لون فلوريسانت
معناته high Escherichia coli لكن زي ما بحكي بالـ
slide إن الـ O157:H7 ما عندها الإنزيم هذا معناته لو
عندى عينة water فيها إشريشيا كولاي O157:H7 بعرضها لـ
UV مش هيصير تغيير في اللون whereas most other
serogroups of إشريشيا كولاي gave positive reactions
أن الأنواع التانية من الإشريشيا كولاي other than
الإشريشيا كولاي O157:H7 هتكون positive للسوربيتول
هتكون سوربيتول fermenter وكمان positive من ناحية
الجلوكورونيداز يعني عندها الإنزيم الإشريشيا كولاي
O157:H7 برضه معناته is pathogenic to man المقصود
بالمان مش معناها المال، معناها الـ human هي ممرضة
للـ human has a low infective dose يعني مقدار بسيط
أو كمية بسيطة من البكتيريا بتعمل disease يعني ال
pathogenicity عندها عالية and laboratory acquired
infections have been reported المختبرات بمجرد ما
يصلهم إنه في infection بشري بالإشريشيا كولاي O157:H7 لازم
إنهم يخبروا الجهات المسؤولة Therefore, the
isolation and identification of this organism لما
بدهم يعزلوا أو يتعرفوا علي الإشريشيا كولاي O157
المسؤولة عن هذه المهمة هم ناس بيكونوا trained
personnel ناس مدربين كيف أنهم يتعاملوا مع العينات
اللي فيها ال pathogenic الإشريشيا كولاي in
appropriately equipped مختبرات برضه بتكون
المختبرات مجهزة بالأدوات والمعدات اللازمة وتحت
إشراف من الـ qualified microbiologist اليوم
بدي يصير detection للإشريشيا كولاي O157:H7 في الـ
food the method has been shown to produce
satisfactory results with artificially
contaminated meats ممكن يكون أنه بنعزل ال bacteria
من اللحوم سواء كانت البيف اللحم البقري الفيل اللي
هي لحم العجل و الـ pork لحم الخنزير ممكن كمان
تكون موجودة في الـ vegetables في الـ dairy product
في الـ spices التوابل و الـ environmental samples
this method can be used successfully for the
detection of Escherichia coli O157 in other foods
برضه في الـ food ingredients في مكونات الطعام
بالإضافة لـ environmental samples الشغل بدي يكون
كالتالي، بتجيب لي العينة هي بتكون يعني الـ sample unit
بدي آخذ منها الـ analytical unit بأخذ 25 جرام أو 25
مل حسب الحالة الفيزيائية للـ sample تمام بروح أحطها
في 225 مل من الـ media broth اسمها الـ tryptic soy
broth TSPهي ميديا وسط غذائي في أوساط ثانية ممكن
أستخدمها؟ اه في، هنتعرف عليها لقدام هيك صار عندي
التخفيف واحد لعشرة كيف صار خمسة وعشرين جرام أو مل
من العينة بحط عليها 225 مل من
الـ tryptic soy broth شو هالـ tryptic soy broth؟ هي
pre-enrichment media يعني ميديا بتثري نمو
البكتيريا، بتحسّن الظروف اللي موجودة فيها البكتيريا
بدون أن تؤثر على العدد، العدد ما بيزيد في الميديا
هاي إن أنا فقط أعملها resuscitation، يعني أنا
بعملها إنعاش، يعني أول خطوة اسمها الـ Primary
Enrichment إيش هي الـ Primary Enrichment؟ يعني بقى
حط العينة بتاعتي في ميديا بتثري نمو البكتيريا بتحسن
من الظروف الموجودة فيها بتعملها إنعاش لكن ما بتزود
العدد طيب مشان أخلي أنه البكتيريا يصير لها إنعاش
وتترى من نمو البكتيريا بروح أسمح لها بفترة 24 hour
incubator على درجة حرارة 42 سيليزياس هاي الخطوة
الأولى سميناها الـ primary enrichment بعد هيك شو
بعمل؟ بعمل selective culture agar حكيت كلمة agar
معناها بدي أزرع على طبق بروح آخذ 100 مايكرون من
الـ Primary enrichment بروح آخذ من الـ Tryptic
soy broth اللي فيها البكتيريا بعد فترة الـ
Incubation طبعًا خلصت الـ 24 ساعة بروح آخذ 100
مايكرون بروح أزرع على الطبق قولنا هنستخدم ميديا
اسمها لإنها بتميّز الاشريكية كلها يعني الاشريكية كلها
O157:H7 هيطلع لون البكتيريا لون colorless إذا
كانت O157:H7 هل هيك بكون متأكدة 100% إن اللون الـ
colorless بنتها اشريكية كولاي O157:H7؟ الجواب لأ لازم
أعمل بعد هيك خطوة الـ biochemical test وبعد هيك
بعمل الـ confirmatory test الـ biochemical test هي
فحوصات تعريفية إنها بعمل زي مثلا الـ Invic فالاشريكية
يكون O157:H7 هتكون positive positive negative
negative نيجي على الـ confirmatory test اللي هي الـ
serology test antigen antibody reaction مثال عليها
زي ما بتعرفوا اللي هي latex agglutination test
فكرة الـ latex هيكون عندي فيها card الـ card فيها
دوائر لها دي الدوائر بحط عليها الـ Antigen و الـ
Antibody وبعدين بعملهم mix وبشوف هل صار
agglutination أو لأ أنا عينتي بدي أكشف فيها هل
موجود إشريكية كولاي أو لأ معناته الإشريكية كولاي
تعتبر Antigen فالشركات المصنعة بتكون مصنعين عالي
two vials علبتين بيشبهوا زي تحت القطرة هيكون vial
اسمها O157 Antisera يعني Antibody للـ Antigen اللي
اسمه O157 الـ Vial الثاني اسمه H7 Antisera يعني
Antibody موجه للـ H7 شو بعمل؟ بروح باخذ الـ drop من
الـ O157 Antisera بحطه على دائرة من الدوائر بروح
بأخذ الـ drop من الـ H7 Antisera بروح بحطه على
دائرة ثانية منفصلة طبعًا بعد هيك لو كانت عندي
البكتيريا على شكل كولونيه بروح آخذ مسحة من
البكتيريا بحطها على أول دائرة بروح باخذ مسحة ثانية
من البكتيريا وبحطها على الدائرة الثانية بعملهم
mix وبشوف هل صار agglutination أو لا مشان أحكي
هاي فعلًا اشريكية كولاي O157:H7 لازم يصير
agglutination في الدائرتين معنى الـ agglutination
أنه العينة اللي عندي فعلًا بتمتلك Antigen اسمه O157
وبتمتلك Antigen اسمه H7 لهيك صار agglutination في
الدائرتين طيب لو
كان في عندي فقط agglutination في الـ O157 antisera
معناها البكتيريا اللي عندي هي عندها O157 عندها
O157 Antigen لكن ما عندها H7 معناها هي الاشريكية
الكولاي O157 not H7 طيب لو ما طلع agglutination
خالص معناته البكتيريا هذه مش O157:H7 طيب
لاحظوا أنا حكيت من ضمن الخطوات أول خطوة اللي هي الـ
primary enrichment هل معنى الكلام في secondary
enrichment الجواب لا في secondary enrichment طيب
ليش ما سردناها من ضمن الـ steps لإن مش كل العينات
بحاجة إننا نعمل لها secondary enrichment طيب شو هي
فكرة الـ secondary enrichment بعد ما أخلص الـ
primary وبعملها incubation لمدة 24 ساعة على درجة
حرارة 42 بروح باخذ واحد مل من الـ flask هذا بروح أحط
في tube في تسعة مل من الـ media هيك صارت تخفيف عندي
عشرة أقل سالب اتنين ليش عشرة أقل سالب واحد لأ
ل tube بالإضافة أنا واخدة من flask تخفيفه عشرة أقل
سالب واحد طيب هيك صرت عاملة الـ secondary enrichment
بعملها incubation وبعد هيك بروح أكمل الخطوات عادي
بروح أعمل selective culture agar بروح بعمل بعد هيك
الـ biochemical test و الـ confirmatory test طيب متى
بلجأ لاستخدام الـ secondary enrichment؟ لما أكون
بدي أعزل الاشريكية coli O157 من بعض أنواع الـ foods زي
الـ spices، التوابل، الـ onion، البصل و الـ garlic،
الثوم الـ food had فيها antimicrobial effect يعني
عندها القدرة إنها تؤثر على عدد الاشريكية coli O157
اللي في العينات هاي فاحنا حكينا ما بدنا العدد يتأثر
لهيك بحاجة إننا نعمل secondary enrichment لإن فكرة
الـ onion و الـ spices و الـ garlic نفس فكرة
الـ antibiotic تقضي أو ممكن تقلل من عدد البكتيريا
فبدي أحافظ على العدد زي ما هو بروح بعمل secondary
enrichment اللي هي قولت بروح باخذ من الـ flask واحد
مل بروح أحطه على tube في تسعة مل من الـ media تمام،
هذا الشيء بيعمل أنه بيغذي الاشريكية Coli O157:H7
طيب أول حاجة ليش بعمل secondary enrichment to
reduce antimicrobial effect لحتى أقلل من الـ
antimicrobial effect لبعض العينات كمان شغلة ثانية
بحتاج أعملها secondary enrichment لما يكون في
microbial load في العينة يعني العينة فيها عدد
بكتيريا كتير غير الاشريكية كولاي O157:H7 معناته
هيك هيصير في منافسة على الـ nutrient فممكن هي هي
البكتيريا الأخرى تستولي على الـ nutrient أو
المغذيات اللي في الـ media فابحاجة إنه يكون في
العينة إن يكون فيها وسط، هذا الوسط فقط بنمّل
إشريكية كولاي O157:H7 وبيعمل inhibition أو بيثبت نمو
باقي أنواع البكتيريا لهيك بنعمل secondary
enrichment to reduce microbial load لحتى أقلل من
عدد البكتيريا اللي هي بتكون other than إشريكية كولاي
O157:H7 الـ Principle نفس الخطوات اللي قلناهم إنّه
أول شيء هيكون فيه selective enrichment بعد هيك راح
أعمل isolation from enrichment culture راح أنميها
على selective culture agar بعد خطوة الـ primary
enrichment وبعد هيك بدي أعزلها باستخدام الـ
monomagnetic separation اللي هو بدي أكون في مجال
مغناطيسي هذا طبعًا هنتعرف عليها لقدام وبعدين
subculture to selective agar the selective agar
cultures are examined for characteristic colorless
بعد ما أزرع على selective culture agar بروح أطلع
على الـ show على اللون اللي بيكون colorless طيب، هل
هيك بأقول متأكدة أن هاي إشريكية كولاي O157:H7؟ قولنا
لأ، شو بعمل؟ confirmation of pre-sumptive لسه هاي
pre-sumptive بفترض لك أنا مش متأكدة إنها O157:H7
كيف بيصير الـ confirmation من خلال الـ biochemical
و الـ serological test أنا قولت بالبداية في خطوة الـ
primary enrichment إنّه باخذ 25 جرام أو مل من العينة
بروح أحطها 225 الـ tryptic soy broth أو أنواع ثانية من الـ
media هنتعرف عليها لقدام فهاد هو الـ media اللي
هتتلزمها Modified tryptic soy broth لـ tryptic soy
broth هي media general صارت سايلها modification
حطوا فيها النوفو بيوسين النوفو بيوسين هو
antibiotic شو بيعمل؟ بيعمل inhibition لـ gram
positive بكتيريا هيك سموها Modified Tryptic Soy
Broth في كمان Interior Hemorrhagic Atrial Coli
Enrichment Broth EEP طبعًا Interior Hemorrhagic
Atrial Coli ده هو اسم تاني لـ *E. coli* O157H7
Modified Hemorrhagic Coli Agar with Tellurite and
Cephalidin إيش هو Tellurite؟ هاد selective agent
Cephalidin هو antibiotic، modified sorbitol ماكنكي
الأجار اللي هي الأسماك طبعا هاي أجار بتلزمني في حالة
ال selective culture أجار فالخطوة التانية modified
ليش؟ لأنه شيلنا منها ال lactose و حطينا بداله ال
sorbitol ال media هاي فيها till you write ك
selective agent، Cefexime، Antibiotic، Cefsulodine
برضه كمان Antibiotic الـ cell bios شو هو؟ هو الـ
di-saccharide بنتج من الهيدروليس لسيريلوز كمان
بنحتاج لكشغل في البحث عن إشريتشيا like O157H7 بحتاج
إلى نصف المية بوتاسيوم صلفات لشو بحتاجه needed for
some spices and foods containing large amount of
spices بحتاج في حالة لو .. لو كان عندي spices أو
لو كان في مثلا
لو كانت عينة لحمة و فيها كمية كبيرة من ال spices
شو بتعمل هاي؟البوتاسيوم سالفات بأستخدمه لحتى أقلل
من الـ antimicrobial effect أنا قولت إنه ال spices
بالإضافة إنه أنا بأعمل secondary enrichment برضه
بأضيف نصف المية بوتاسيوم سالفات فلو سألتكم سؤال
بالامتحان مثلا لو عندك لحمةواللحمة طبعا كان فيها
spices شو هي الخطوات بأعملها from A to Z من
البداية بمجرد ما تصلني طبعا هذه عينة solid بالنسبة
لل sample unit بدي أخد من أكتر من مكان بعد هيك
بعملها لـ Treatment و لـ Preparation الصح و لو بدي
أبحث فيها مثلا في السوقة اللي كانت نوعية اللحمة
بدي أبحث فيها على إشريشيا كولاي O157-H7 بدي أضيفه
إنه إحنا بنعمل الخطوات
كلهيتهم و بدي أضيف إنه بدي أحط عليها بوتاسيوم
صلفية to reduce antimicrobial effect كمان بنحتاج
للـHCl و لـNa وH هدول إتنين بيضبطوا الـpH للـfood
قلنا لازم ال food يكون متعادل لإن لو كان acidic or
basic هيأثر على ال pH indicator بتاع ال media ال
pH meter بيقيص ال pH سومكر البلندر أو أي إشي من
هذه القبيل بيستخدم إنه بيخلي العينة homogeneous
بيحولها من solid إلى liquid control culture اللي
هي ال ATCC قلنا high American type culture
collection اللي هي بتكون بكتيريا معرفة عالمياً
بنحتاج كـ Positive Control هي شريشة كولاي O157H7
Negative Control شريشة كولاي مش O157H7 بنحتاج كمان
لـ Incubator و لميديات لـ Tryptic Soy Agar With
Yeast Extract هذه كان ممكن نحتاجهم Rapid
Identification Kit زي اللي هي الـ API Analytical
Profile Index الـ Lytic Agglutination Kits هي أنتجن
أنتبادي الـ MVC هي Biochemical Test يوريا
أجار سلاند ممكن أحتاج إلى اليوريا فلو كانت
البكتيريا عندها أنزيم اليورياس هتكسر اليوريا اللي
في الميديا و هتحطيني أمونيا الأمونيا بترفع ال pH
هيصير اللون الوسط بدل ما هو أصفر بتحول إلى اللون
pink ممكن أنكم تشوفوه يعني فوشي فوشي يعني يعني على
الآخر بيكون واضح الـMUG هد هو الـreagent لو كان
البكتيريا عندها الـglucorindiase هتتغير اللون،
هيصير fluorescent لكن الشريشة Chloe O157H7 ما
عندها، الإنزيم هد وبالتالي مش هيصير fluorescent
ممكن كمان إنه نستخدم reagent تاني other than
الـMUG اللي هو الـbromochloroendrogluconide نحتاج
الـO157 وH7-antisera مشان لما نشتغل الـ
confirmatory test اللي هو الـ latex agglutination