Ozon u restaurativnoj stomatološkoj terapiji: antibakterijski efekat i uticaj na VEGF u zubnoj pulpi

Univerzitet u Istočnom Sarajevu, Medicinski fakultet Foča

UNIVERZITET U ISTOČNOM SARAJEVU
MEDICINSKI FAKULTET

Jelena B. Krunić

„OZON U RESTAURATIVNOJ STOMATOLOŠKOJ TERAPIJI:
ANTIBAKTERIJSKI EFEKAT I UTICAJ NA VEGF U ZUBNOJ
PULPI“

DOKTORSKA DISERTACIJA

Foča, jul 2015. godine

Bibliografski podaci:

UDK
546.214:616.314-089.27
Naučna oblast
Medicinske i zdravstvene nauke
Naučno polje
Klinička medicina
Uža naučna oblast
Stomatologija, oralna hirurgija i medicina
Institucija
Medicinski fakultet Univerziteta u Istočnom
Sarajevu
Mentor rada
Prof.
dr
Dragica
Stojić,
redovni
profesor
Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu
Broj stranica
87
Broj slika
2
Broj tabela
22
Broj priloga
0
Broj literaturnih referenci
240
Datum odbrane

Komisija za odbranu:

1. Prof. dr Slavoljub Živković, Stomatološki fakultet Univerziteta u Beogradu, komentor i član komisije
2. Doc. dr Nikola Stojanović, Medicinski fakultet Univerziteta u Istočnom Sarajevu, član komisije
3. Doc. dr Lado Davidović, Medicinski fakultet Univerziteta u Istočnom Sarajevu, član komisije
4. Doc. dr Jelena Roganović, Stomatološki fakultet Univerziteta u Beogradu, član komisije
5. Doc. dr Branka Popović, Stomatološki fakultet Univerziteta u Beogradu, član komisije

Rad je odložen u biblioteci Medicinskog fakulteta

...mom Bogdanu na nebu i
mojoj Nadi na zemlji...
Ova doktorska teza je urađena na Medicinskom fakultetu Univerziteta u Istočnom Sarajevu, u saradnji sa
Službom za medicinsku mikrobiologiju sa parazitologijom i virusologijom Univerzitetske bolnice u Foči,
Institutom za stomatološku farmakologiju i Institutom za humanu genetiku Stomatološkog fakulteta
Univerziteta u Beogradu. Dio teze je urađen u sklopu projekta „Ozon u restaurativnoj i endodontskoj
stomatološkoj terapiji: antibakterijski efekat i uticaj na VEGF u zubnoj pulpi“ finansiranog od strane
Ministarstva nauke i tehnologije RS (broj: 19/06-020/961-174/12).

Zahvaljujem:
mentoru, prof. dr Dragici Stojić, sa Instituta za stomatološku farmakologiju Stomatološkog fakulteta u
Beogradu, koja me je upoznala sa naučnim svijetom i vodila sa velikom profesionalnošću kroz
dodiplomske i poslijediplomske studije. Hvala joj što me je, više od deceniju, strpljivo usmjeravala,
prijateljski pomagala, nesebično dijelila svoje ogromno znanje i iskustvo, učila da sagledavam
kompleksnije i sveobuhvatnije i  uvijek bila dostupna i kao učitelj i kao prijatelj;
komentoru, prof. dr Slavoljubu Živkoviću, sa Klinike za bolesti zuba Stomatološkog fakulteta u
Beogradu, za veliko razumijevanje, svesrdnu podršku u svim fazama rada i sugestijama koje su oblikovale
ovaj rad;
doc. dr Nikoli Stojanoviću, koji mi je prenio nepocjenjivo praktično i stručno znanje neophodno za
izradu ovog doktorskog rada, na posvećenosti i stalnom podsticaju;
doc. dr Jeleni Roganović i asist. dr Ljiljani Đukić, sa Instituta za stomatološku farmakologiju
Stomatološkog fakulteta u Beogradu, koje su me upoznale sa ELISA imunoesejskim protokolom, uradile
sve potrebne analize, kao i one koje prevazilaze okvire ovog doktorata, a posebno na njihovoj predanosti  i
nesebičnoj podršci;
doc. dr Branki Popović, sa Instituta za humanu genetiku Stomatološkog fakulteta u Beogradu, za
susretljivost, podršku i nesebičnu pomoć u organizaciji i realizaciji molekularnih analiza i dragocjenim
smjernicama za interpretaciju rezultata;
doc. dr Ladu Davidoviću, za svesrdnu podršku i angažovanje tokom cijelog istraživanja;
prof. dr Slobodanki Đukić, sa Instituta za mikrobiologiju i imunologiju Medicinskog fakulteta u
Beogradu, na konstruktivnim savjetima i smjernicama za definisanje eksperimentalnog protokola za
mikrobiološku analizu i tumačenju rezultata;
prim. dr Radi Mrgud i dr Ružici Lukić, kao i svom osoblju Službe za medicinsku mikrobiologiju sa
parazitologijom i viruslogijom Univerzitetske bolnice u Foči, koji su otvorili vrata svoje laboratorije za
mikrobiološku analizu i učinili da se osjećam dijelom njihovog tima;
dr sc. Ivani Simić, na pomoći pri prikupljanju uzoraka i cjelokupnom angažovanju oko dijela kliničkog
istraživanja;
stomatološkim sestrama pri Katedri za bolesti zuba i endodonciju i Katedri za oralnu rehabilitaciju, kao i
Službi za biohemiju i hematologiju Univerzitetske bolnice u Foči za tehničku podršku;
kolegama sa Katedre za bolesti zuba i endodonciju, a posebno v. asist. dr Brankici Davidović,
na podršci, pomoći, razumijevanju i smijehu;
prijateljima, jer su uvijek tu.
Najveću zahvalnost dugujem onima koji su me podržavali uvijek i u svemu, i bez kojih ovo sve ne bi bilo
moguće-porodici.

OZON U RESTAURATIVNOJ STOMATOLOŠKOJ TERAPIJI: ANTIBAKTERIJSKI EFEKAT I UTICAJ NA VEGF U
ZUBNOJ PULPI

REZIME
Uvod. Ozon ima široku primjenu u medicini, a posljednjih godina se primjenjuje u stomatologiji zbog
izraženog antimikrobnog djelovanja bez pojave antimikrobne rezistencije. Manji broj kliničkih studija
ukazuje na mogućnost primjene ozona u terapiji karijesnih lezija i za dezinfekciju kaviteta. Za
odontoantiseptike je od značaja njihov farmakodinamski efekat kao i njihov bezbjednosni profil. Najveći
broj do sada objavljenih radova o antibakterijskoj efikasnosti ozona na kariogene bakterije odnosi se na
rezultate in vitro studija, a mali broj radova na ispitivanje biokompatibilnosti ozona na zubnu pulpu in vivo.
Cilj. Cilj ove teze je bio da se ispita antibakterijski efekat primjene ozona na ukupan broj bakterija,
Lactobacillus spp. i pojedine vrste Lactobacillus spp. poslije nepotpunog uklanjanja karijesa, kao i da se
odredi koncentracija vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) i superoksid dismutaze (SOD) u zubnoj
pulpi zdravih zuba poslije primjene ozona. Materijal i metode. Studija I je uključila ukupno 48 zdravih
osoba oba pola, starosti od 19-48 godina, kod kojih je dijagnostikovana najmanje jedna duboka karijesna
lezija (>1/2 debljine dentina) na okluzalnoj ili okluzalnoj i aproksimalnoj površini bočnog zuba. Ispitanici su
u zavisnosti od primjenjenog antiseptika za dezinfekciju kaviteta podijeljeni u dvije grupe:
eksperimentalna, u kojoj je korišćen ozon u obliku gasa, i komparativna grupa, gdje je primjenjen 2%
hlorheksidin. Uzorci dentina su uzeti iz karijesnih kaviteta poslije nepotpunog uklanjanja karijesa i poslije
primjene antiseptika i analizirani su kultivisanjem, lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i „real-time“ PCR
(qPCR). Studijom II su obuhvaćene 38 zdrave osobe oba pola, starosti 18-40, kod kojih je indikovana
ekstrakcija intaktnih i klinički zdravih donjih molara. Poslije preparacije kaviteta na okluzalnoj površini
zuba u eksperimentalnoj grupi je primjenjen ozon u obliku gasa, dok u kontrolnoj grupi kaviteti nisu
tretirani (fiziološki rastvor). U zubnim pulpama određen je nivo VEGF imunoesejskom tehnikom (ELISA) i
nivo SOD spektrofotometrijskom metodom. Rezultati. Studija I. Jednokratna primjena ozona i
hlorheksidina u preparisani kavitet je dovela do značajnog smanjenja ukupnog broja aerobnih i
anaerobnih bakterija, Streptococcus spp., Lactobacillus spp., ali ne i pojednih vrsta Lactobacillus spp.,
nezavisno od metode identifikacije bakterija. Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i
hlorheksidina ispitivana metodom kultivisanja je pokazala da je ozon izazvao značajno smanjenje broja
Lactobacillus spp. (p=0,041), a hlorheksidin značajno smanjenje broja Streptococcus spp. (p=0,041).
Primjenom PCR i qPCR metode nije zabilježena razlika u efikasnosti ozona i hlorheksidina na kariogene
bakterije.  Studija II. Koncentracija VEGF u grupi tretiranoj ozonom je bila značajno veća (p<0,0001), a nivo
SOD značajno manji (p=0,002) u odnosu na vrijednosti dobijene za pulpe kontrolnih zuba. Zaključci.
Komparativna analiza rezultata o antibakterijskoj efikasnosti jednokratno primjenjenog ozona i 2%
hlorheksidina u ispreparisani kavitet zuba pokazuje da su oba antiseptika podjednako efikasna. Poslije
jednokratne primjene ozona kao antiseptika u kavitet zuba povećava se nivo VEGF, koji ne predstavlja
patološko povećanje, i aktivira se antioksidativni sistem u tkivu pulpe, što ukazuje na njegovu
biokompatibilnost sa zubnom pulpom.
Ključne riječi: ELISA, ispitivanje biokompatibilnosti, kultivisanje, ozon, PCR, SOD, VEGF
OZONE IN RESTORATIVE THERAPY: ANTIBACTERIAL EFFECT AND THE IMPACT ON VEGF IN DENTAL PULP

SUMMARY
Introduction. Ozone is widely used in medicine, and recently it is used in dentistry due to its strong
antimicrobial activity without antimicrobial resistance. A small number of clinical studies evaluated the
effect of ozone in therapy of dental caries and for cavity disinfection. For dental antiseptics use, both their
pharmacodynamic effects and safety profile are of the importance. Most of published works considering
the antibacterial effect of ozone on cariogenic bacteria has been conducted in vitro, and a small number
of studies investigated biocompatibility of ozone on dental pulp in vivo. Aim. The aim of this thesis was to
investigate the effect of ozone on total bacteria, Lactobacillus spp., and different Lactobacillus spp. strains
after incomplete caries removal, as well as to determine the concentration of vascular endothelial growth
factor (VEGF) and superoxide dismutase (SOD) in the dental pulp of healthy teeth after ozone application.
Material and methods. Study I included 48 healthy subjects of both gender, aged 19-48 years, with at
least one tooth with diagnosed deep caries (> 1/2 of the thickness of dentin) on occlusal or occlusal and
interproximal tooth surface. Subjects were divided into two groups according to the cavity disinfectant
used: the experimental group, where ozone gas was used, and the comparative group, where 2%
chlorhexidine was used. Dentine samples were taken from the cavity after partial caries removal and after
application of antiseptic, and analyzed using cultivation, polymerase chain reaction (PCR) and "real-time"
PCR (qPCR) methods. Study II included 38 healthy subjects of both gender, aged 18-40 years, in which the
extraction of sound mandibular molars were indicated. After cavity preparation on the occlusal surface of
the tooth ozone gas was applied in the experimental group, while saline was applied in the control group.
The levels of VEGF and SOD in dental pulp were determined by immunoassay technique (ELISA) and by
spectrophotometric method, respectively. Results. Study I. Single application of ozone and chlorhexidine
into the cavity resulted in a significant decrease of the total number of aerobic and anaerobic bacteria,
Streptococcus spp., and Lactobacillus spp., but not of the Lactobacillus spp. strains, irrespective of the
method for bacteria enumeration. Comparative analysis of antibacterial effect of ozone and chlorhexidine
using cultivation revealed that the number of Lactobacillus spp. was significantly lower in the ozone group
while the number of Streptococcus spp. was significantly lower after chlorhexidine treatment (p=0.041).
By using PCR and qPCR methods, no difference in the effectiveness of ozone and chlorhexidine on
cariogenic bacteria was noted. Study II. In the group treated with ozone the concentration of VEGF was
significantly higher (p<0.0001), and the level of SOD was significantly lower (p=0.002) compared to the
values obtained for the control pulps. Conclusions. Comparative analysis of the antibacterial efficiency of
once applied ozone and 2% chlorhexidine in tooth cavities indicates that both antiseptics are equally
effective. After single application of ozone in tooth cavity the level of VEGF in dental pulp increases, which
does not present pathological increase, and the antioxidant system activates, which indicates its
biocompatibility with dental pulp.

Key words: ELISA, biocompatibility testing, cultivation, ozone, PCR, SOD, VEGF
Sadržaj

1. UVOD .....................................................................................................................................................
1
1.1. KARIJES ZUBA I HIPOTEZE O NJEGOVOM NASTANKU ........................................................................
1
1.2. MIKROORGANIZMI PROUZROKOVAČI KARIJESA ................................................................................
2
1.3. PRINCIPI TERAPIJE DUBOKOG KARIJESA.............................................................................................
4
1.4. EFIKASNOST ODONTOANTISEPTIKA U RESTAURATIVNOJ TERAPIJI ...................................................
5
1.4.1. Hlorheksidin ................................................................................................................................
5
1.4.2. Etilendiaminotetraacetatna kiselina ...........................................................................................
7
1.4.3. Natrijum hipohlorit
......................................................................................................................
7
1.4.4. Vodonik peroksid
.........................................................................................................................
8
1.4.5. Druga sredstva sa antiseptičkim djelovanjem
.............................................................................
8
1.5. OZON KAO ODONTOANTISEPTIK
........................................................................................................
9
1.6. PRINCIPI ISPITIVANJA BEZBJEDNOSTI ODONTOANTISEPTIKA ..........................................................
12
2. RADNA HIPOTEZA ....................................................................................................................................
16
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
..............................................................................................................................
18
4. MATERIJAL I METODE
..............................................................................................................................
20
4.1. DIZAJN STUDIJE ................................................................................................................................
20
4.2. ISPITANICI .........................................................................................................................................
20
4.2.1. Studija I: antibakterijski efekat ozona u karijesnim kavitetima zuba. .......................................
20
4.2.2. Studija II: biokompatibilnost ozona u odnosu na zubnu pulpu.
................................................
20
4.2.3. Veličina uzorka ..........................................................................................................................
21
4.2.4. Randomizacija ...........................................................................................................................
21
4.3. KLINIČKA PROCEDURA I UZIMANJE UZORAKA .................................................................................
21
4.3.1. Studija I
......................................................................................................................................
21
4.3.2. Studija II
.....................................................................................................................................
22
4.4. MIKROBIOLOŠKA ANALIZA UZORAKA ..............................................................................................
23
4.4.1. Određivanje ukupnog broja bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. metodom
kultivisanja
...........................................................................................................................................
23
4.4.2. Identifikacija različitih vrsta Lactobacillus spp. biohemijskim testom ......................................
23
4.4.3. Određivanje ukupnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. „real-time“ lančanom
reakcijom polimeraze (qPCR) ..............................................................................................................
24
4.4.4. Određivanje učestalosti vrste Lactobacillus casei/paracasei lančanom reakcijom polimeraze
(PCR) ....................................................................................................................................................
26
4.5. KVANTIFIKACIJA VEGF I SOD U ZUBNOJ PULPI .................................................................................
26
4.5.1. Priprema uzoraka ......................................................................................................................
26
4.5.2. Određivanje nivoa VEGF u zubnoj pulpi imunoesejskom tehnikom .........................................
26
4.5.3. Određivanje nivoa SOD u zubnoj pulpi spektrofotometrijskom metodom ..............................
27
4.6. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA
....................................................................................................
27
5. REZULTATI ISTRAŽIVANJA
........................................................................................................................
31
5.1. KARAKTERISTIKE ISPITANIKA I KARIJESNOG UZORKA ..........................................................................
31
5.2. ANTIBAKTERIJSKI EFEKAT OZONA ........................................................................................................
35
5.2.1. Efekti ozona i hlorheksidina na ukupan broj bakterija ispitivani metodom kultivisanja ..............
35
5.2.1.1. Broj kaviteta sa aerobnim bakterijama
..................................................................................
35
5.2.1.2. Prosječan broj aerobnih bakterija ..........................................................................................
35
5.2.1.3. Broj kaviteta sa anaerobnim bakterijama
..............................................................................
36
5.2.1.4. Prosječan broj anaerobnih bakterija ......................................................................................
37
5.2.2. Efekti ozona i hlorheksidina na Lactobacillus spp. ispitivani metodom kultivisanja i biohemijskom
analizom ..................................................................................................................................................
37
5.2.2.1. Broj kaviteta sa Lactobacillus spp. .........................................................................................
37
5.2.2.2. Prosječan broj Lactobacillus spp.............................................................................................
38
5.2.2.3. Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp.
.........................................................................
39
5.2.3. Efekti ozona i hlorheksidina na Streptococcus spp. ispitivani metodom kultivisanja ...................
42
5.2.3.1. Broj kaviteta sa Streptococcus spp.
........................................................................................
42
5.2.3.2. Prosječan broj Streptococcus spp. ..........................................................................................
42
5.2.4. Korelacija kliničkih karakteristika lezije i prosječnog broja bakterija u cjelokupnom uzorku
.......
43
5.2.5. Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina ispitivanog metodom
kultivisanja...............................................................................................................................................
44
5.2.5.1. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije, Lactobacillus
spp. i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika ...........................................................................
44
5.2.5.2. Poređenje prosječnog broja aerobnih bakterija, anaerobnih bakterije, Lactobacillus spp. i
Streptococcus spp. prije primjene antiseptika
.....................................................................................
45
5.2.5.3. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na različite vrste Lactobacillus spp. prije primjene
antiseptika ...........................................................................................................................................
46
5.2.5.4. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije, Lactobacillus
spp. i Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika ........................................................................
47
5.2.5.5. Poređenje prosječnog broja aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i
Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika .................................................................................
48
5.2.5.6. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na različite vrste Lactobacillus spp. poslije primjene
antiseptika ...........................................................................................................................................
48
5.2.6. Efekti ozona i hlorheksidina na ukupan broj bakterija ispitivani metodom qPCR ........................
50
5.2.6.1. Broj kaviteta sa anaerobnim bakterijama
..............................................................................
50
5.2.6.2. Prosječan broj anaerobnih bakterija ......................................................................................
50
5.2.7. Efekti ozona i hlorheksidina na ukupan broj Lactobacillus spp. ispitivani metodom qPCR ..........
51
5.2.7.1. Broj kaviteta sa Lactobacillus spp. .........................................................................................
51
5.2.7.2. Prosječan broj Lactobacillus spp.............................................................................................
52
5.2.8. Efekti ozona i hlorheksidina na prisustvo vrste L. casei/paracasei ispitivani metodom PCR .......
52
5.2.8.1. Broj kaviteta sa L. casei/paracasei .........................................................................................
52
5.2.9. Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina ispitivanog metodom qPCR53
5.2.9.1. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. prije primjene
antiseptika ...........................................................................................................................................
53
5.2.9.2. Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. prije primjene
antiseptika ...........................................................................................................................................
53
5.2.9.3. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. poslije
primjene antiseptika
............................................................................................................................
55
5.2.9.4. Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. poslije primjene
antiseptika ...........................................................................................................................................
55
5.2.10. Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina na vrstu L. casei/paracasei
ispitivanog metodom PCR .......................................................................................................................
56
5.2.10.1. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na L. casei/paracasei prije i poslije primjene antiseptika

.............................................................................................................................................................
56
5.3. KARAKTERISTIKE ISPITANIKA I UZORKA
................................................................................................
59
5.4. EFEKAT OZONA NA NIVO VEGF U ZUBNOJ PULPI.................................................................................
60
5.5. EFEKAT OZONA NA NIVO SOD U ZUBNOJ PULPI ..................................................................................
61
6. DISKUSIJA ................................................................................................................................................
63
7. ZAKLJUČCI ................................................................................................................................................
72
8. LITERATURA
.............................................................................................................................................
74

11
U V O D

1.
UVOD
1.

1
1. UVOD
1.1. KARIJES ZUBA I HIPOTEZE O NJEGOVOM NASTANKU
Karijes predstavlja jedno od najčešćih hroničnih oralnih oboljenja modernog doba koje se i pored široke
primjene profilaktičke terapije javlja kod školske djece sa učestalošću od 30-90%, a kod odraslih do 100%
(Bratthall, 2005; Petersen i sar., 2005). Na pojavu karijesa utiču brojni faktori kao što su ishrana, oralno-
higijenske navike i primjena fluorida. Socio-ekonomski status i genetska predispozicija su takođe od
značaja u etiologiji karijesa. Karijes zuba nastaje kao posljedica interakcije bakterija iz dentalnog plaka,
ugljenih hidrata i brojnih faktora domaćina u funkciji vremena (Selwitz i sar., 2007). Dentalni plak
predstavlja mekanu nemineralizovanu naslagu koja se sastoji od mikroorganizama, adhezivnih
glikoproteina i vanćelijskog mikrobnog polimernog matriksa. Početna karijesna lezija na površini gleđi se
vidi kao kredasto zamućenje-„bijela mrlja“. Ukoliko se ne liječi, lezija napreduje dublje u dentin, uzrokuje
gubitak zubne supstance i pojavu kaviteta, a na kraju i infekciju okolnih struktura.
Postoji nekoliko različitih hipoteza o nastanku karijesa, koje su se razvijale uporedo sa istraživanjima o
sastavu i organizaciji dentalnog plaka. Jedna o prvih hipoteza je bila „hipoteza o specifičnom plaku“ prema
kojoj karijes nastaje kao posljedica djelovanja specifičnih bakterija iz dentalnog plaka (Loesche, 1976), u
prvom redu mutans streptococci i Lactobacillus spp.. Međutim, uočeno je da do razvoja karijesa može doći
i bez prisustva mutans streptococci, kao i da njihovo prisustvo nije uvijek povezano sa procesima
demineralizacije (Marsh i sar., 1989). Ovi nalazi su doveli do razvoja „hipoteze o nespecifičnom plaku“
prema kojoj oboljenje nastaje kao posljedica interakcije svih bakterija dentalnog plaka (Theilade, 1986).
Iako je karijes posmatran kao nespecifično oboljenje, uočeno je da se određene vrste bakterija češće
izoluju sa oboljelih mjesta i da se razlikuju od onih koje se nalaze na zdravim površinama zuba. To je
dovelo do razvoja „hipoteze o ekološkom plaku“ (Marsh, 2003; Takahashi i Nyvad, 2011). Prema ovoj
hipotezi u dentalnom plaku, kao dinamičkom ekosistemu, ne-mutansne bakterije imaju glavnu ulogu u
održavanju homeostaze (stadijum dinamičke stabilnosti). Promjene u spoljašnoj sredini (smanjeno lučenje
pljuvačke ili povećan unos ugljenih hidrata) dovode do povećane produkcije kiselina i povećanja broja
acidogenih bakterija kao i bakterija koje tolerišu niske vrijednosti pH. Ovaj poremećaj destabilizuje
bakterijsku homeostazu i balans procesa remineralizacije-demineralizacije što za posljedicu ima gubitak
mineralnih materija (acidogeni stadijum). Kada se uspostavi acidogena sredina, raste broj mutans grupe
Streptococcus spp. i drugih bakterija koje podnose kiselu sredinu i tako dovode do nastanka lezije
(stadijum acidogene tolerancije). Skorija istraživanja Simón-Soro i sar. (2013) i Simón-Soro i Mira (2015)
ukazuju i na „tkivno-zavisnu hipotezu“ u nastanku karijesa. Ovom hipotezom uočava se razlika u vrsti
bakterija prouzrokovača karijesa u zavisnosti od toga da li je u pitanju karijes dentina ili karijes gleđi. U
odnosu na gleđ, dentin predstavlja drugačiju ekološku sredinu za kariogene bakterije jer sadrži više
organskih materija i manje mineralnih materija; hidroksiapatit dentina je siromašniji kalcijumom a bogatiji
karbonatima, a razgradnja dentina se odvija pri višim vrijednostima pH (Vanuspong i sar., 2002; Berkovitz i
UVOD
1.

2
sar., 2009). Karijesne lezije u gleđi karakteriše prisustvo acidogenih bakterija koje adheriraju na zubna
tkiva i koje fermentišu ugljene hidrate. Sa druge strane u dentinskim lezijama se u većem broju nalaze
proteolitičke, anaerobne bakterije koje su zavisne od osmotskog pritiska (Simón-Soro i sar.,2013; Simón-
Soro i sar., 2014; Simón-Soro i Mira, 2015).

1.2. MIKROORGANIZMI PROUZROKOVAČI KARIJESA
Centralna uloga za nastanak karijesa se pripisuje mutans streptococci i Lactobacillus spp.. Smatra se da
mutans streptococci (Streptococcus mutans i Streptococcus sobrinus) iniciraju karijesni proces na površini
krunice i/ili korijena. Dokazi za ovo su radovi u kojima je pokazano da se ove bakterije često izoluju iz
karijesnih kaviteta, uzrokuju karijes u eksperimentalnim uslovima, stvaraju kiseline, dobro podnose kiselu
sredinu i imaju sposobnost stvaranja površinskih antigena I/II i u vodi nerastvorljivog glukana, koji
olakšavaju njihovu adheziju za zubna tkiva i druge bakterije (Hamada i Slade, 1980). Takođe, mogu da
prežive i u nedostatku egzogenih ugljenih hidrata jer deponuju intracelularne polisaharide (Takahashi i
sar., 1991). U slučajevima kada se izoluju iz dubokih karijesnih lezija mutans streptococci nisu uvijek
najbrojnije vrste na ovom nivou karijesne lezije, što ukazuje na značaj drugih acidogenih bakterija ovog
roda u razvoju i progresiji oboljenja (Lima i sar., 2011; Simón-Soro i sar., 2013). Zanimljivo je istaći da kod
10-20% osoba sa aktivnim karijesom nisu izolovane Streptococcus spp. iz mutans grupe (Beighton, 2005;
Aas i sar., 2008). Lactobacillus spp. su najčešće bakterije koje se izoluju iz dubokih karijesnih lezija dentina
što ukazuje na njihov veliki značaj za progresiju karijesnog procesa, ali ne i za nastanak karijesa (Aas i sar.,
2008; Simón-Soro i sar., 2013; Obata i sar., 2014; Simón-Soro i Mira, 2015). Ove bakterije stvaraju kiseline
i podnose izrazito kiselu sredinu. Na činjenicu da Lactobacillus spp. nema značaj u nastanku karijesa
ukazuju nalazi o maloj količini ovih bakterija u dentalnom plaku (Aas i sar., 2008; Simón-Soro i sar., 2013;
Simón-Soro i Mira, 2015)
U posljednih dvadeset pet godina, zahvaljujući uvođenju metoda molekularne biologije, kao što je lančana
reakcija polimeraze (PCR), za izolaciju i identifikaciju bakterija, utvrđeno je da mnogo veći broj bakterija,
za koje se do tada nije znalo, različito učestvuje u dinamici karijesnog procesa: zdrava gleđi, početna
karijesna lezija u gleđi, karijes dentina i duboka karijesna lezija u dentinu.
Supragingivalni dentalni plak zdravih zuba naseljavaju bakterije Actinomyces spp. i Streptococcus spp. iz
mitis grupe (Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis i Streptococcus mitis) (Li i sar., 2004). Sastav
dentalnog plaka na zdravim površinama zuba karakteriše prisustvo i drugih, uglavnom Gram pozitivnih
bakterija. Tako su Aas i sar. (2008) u opsežnoj molekularnoj studiji izolovali Kingella oralis, Eubacterium
saburreum cl. GT038, Gemella morbilorum, Streptococcus cristatus, Streptococcus intermedius,
Streptococcus sp. cl. CH016, Streptococcus sp. grupa H6, Leptotrichia sp. cl. DT031, Eubacterium sp. cl.
EI074, Campylobacter showae, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum i Capnocytophaga
sputigena u većem broju sa površine intaktne gleđi stalnih zuba. Interesantno je spomenuti da su isti
autori uočili razliku u bakterijskom profilu plaka koji prekriva intaktnu gleđ stalnih zuba kod osoba bez
UVOD
1.

3
karijesa i restauracija u poređenju sa intaktnom gleđi osoba sa prisutnim karijesnim lezijama (Aas i sar.,
2008). Gross i sar. (2010) povezuju bakterije S. mitis- Streptococcus pneumoniae- Streptococcus infantis,
Corynebacterium matruchotii, Streptococcus gordonii, S. cristatus, Capnocytophaga gingivalis,
Eubacterium IR009, Campylobacter rectus i Lachnospiraceae sp. C1 sa zdravljem zuba. Sa površine zdrave
gleđi kod osoba bez karijesnih lezija su kao najčešće izolovane S. sanguinis, Treponema spp.,
Capnocytophaga sputigena, Anginosus grupa 3, Fusobacteria spp. 4, S. gordonii, Fusobacteria spp. 1,
Gemella morbillorum i S. mitis u istraživanju Wolff i sar. (2013), odnosno Streptococcus spp., Neisseiria
spp., Corynebacterium spp., Rothia spp., Haemophilus spp. i Veillonella spp. u istraživanju Kianoush i sar.
(2014).
Početnu karijesnu leziju u gleđi karakteriše prisustvo Veillonella spp., Actinomyces sp. cl. GU067, S.
sanguinis, Leptotrichia sp. cl. GT018, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, Eubacterium sp. cl.
EI074, Fusobacterium animalis, Leptotrichia spp., Selenomonas sp. cl. EY047 i S. mitis (Aas i sar., 2008).
Streptococcus spp., Rothia spp., Leptotrichia spp. i Veillonella spp. su najčešće izolovane bakterije iz
karijesnih lezija u gleđi u studiji Simón-Soro i sar. (2014).
Karijesnu lezija u dentinu karakteriše prisustvo 6-37 različitih vrsta bakterija, uglavnom anaerobnih Gram
pozitivnih koka i štapićastih bakterija i Gram negativnih štapićastih bakterija (Martin i sar., 2002; Chhour i
sar., 2005; Aas i sar., 2008; Lima i sar., 2011) i u odnosu na zdravu gleđ i početnu karijesnu leziju u gleđi,
bakterijska raznolikost u dentinu je manja (Aas i sar., 2008; Gross i sar., 2010; Wolff i sar., 2013). U
dentinskim lezijama se najčešće izoluju Lactobacillus spp., Shlegelella spp., Pseudoramibacter spp., i
Atopobium spp. (Simón-Soro i sar., 2014). Kianoush i sar. (2014) nalaze da su najzastupljenije bakterije u
karijesnim kavitetima Lactobacillus spp., Atopobium spp., Olsenella spp., Propionibacterium spp.,
Bifidobacterium spp., Dialister spp., Sphingomonas spp. i Parascardovia spp.. Istraživanje Obata i sar.
(2014) je pokazalo prisustvo Lactobacillus spp., Propionibacterium spp., Atopobium spp., Streptococcus
spp., Prevotella spp., Olsenella spp., Actinomyces spp., Veillonella spp., Pseudoramibacter spp.,
Mitsuokella spp. i Scardovia spp. u karijesnim lezijama u dentinu. Schulze-Schweifing i sar. (2014) su u
dentinskim karijesnim lezijama izolovali rodove bakterija Prevotella, Lactobacillus, Selenomonas i
Streptococcus kao najbrojnije. Isti autori nalaze da su najbrojnije vrste bakterija u uzrocima karijesnog
dentina Lactobacillus gasseri, Prevotella denticola, Alloprevotella tannerae, S. mutans i Streptococcus sp.
HOT 070.
Zanimljivo je istaći da su pojedini autori analizirali različite nivoe dentinske karijesne lezije primjenom
molekularnih tehnika. Tako, Aas i sar. (2008) nalaze u karijesnim lezijama dentina Streptococcus
parasanguinis, Streptococcus salivarius, Leptotrichia sp. cl. GT018, Campylobacter gracilis i Selemonas sp.
cl. EY04 kao najčešće bakterijske vrste, dok u dubokim karijesnim lezijama dentina S. mutans,
Lactobacillus spp., Propionibacterium sp. FMA5  i Atopobium genomospecies C1 kao dominantne bakterije
(Aas i sar., 2008). Munson i sar. (2004) su analizirali uzorke središnjeg i najdubljeg sloja duboke karijesne
lezije dentina i izolovali različite vrste, ali S. mutans, Rothia dentocariosa i Propionibacterium acidifaciens
kao najčešće u oba ispitivana sloja. Lima i sar. (2011) su analizirali tri sloja duboke karijesne lezije dentina:
površinski, središnji i duboki. Autori su uočili da su najbrojnije bakterije u površinskom sloju lezije
Atopobium genomospecies C1, Streptococcus spp., Fusobacterium nucleatum i Veillonella spp.. U
UVOD
1.

4
središnjem sloju najbrojnije su bile Atopobium C1, F. nucleatum, Veillonella spp., Lactobacillus fermentum
i Lactobacillus casei, dok su najdubljim slojevima karijesne lezije dentina najbrojnije bile Atopobium C1, F.
nucleatum, S. mutans, Streptococcus spp. i Veillonella spp. Međutim, ni u jednoj od studija nije zabilježena
značajna razlika u učestalosti različitih vrsta bakterija u odnosu na ispitivani sloj duboke karijesne lezije,
osim za učestalost vrste Olsenella uli u studiji Lima i sar. (2011).

1.3. PRINCIPI TERAPIJE DUBOKOG KARIJESA
Duboka karijesna lezija predstavlja leziju koja je zahvatila veći dio dentina i gdje tanak sloj razmekšanog
dentina razdvaja karijesnu leziju i zubnu pulpu. Terapija dubokog karijesa ima za cilj zaustavljanje
karijesnog procesa, očuvanje vitaliteta pulpe i stimulisanje procesa remineralizacije i dentinogeneze.
Metode indirektnog i direktnog prekrivanja pulpe se koriste u terapiji dubokih karijesnih lezija
(Schwendicke i sar., 2013a).
Postoje dva pristupa indirektnog liječenja dubokog karijesa: jednoseansni i dvoseansni. Kod jednoseansne
terapije poslije djelimičnog uklanjanja karijesa kavitet se adherento zatvara definitivnim ispunom u prvoj i
jedinoj posjeti. Količina karijesnog tkiva koja se uklanja varira. Naime, u nekim istraživanjima kavitet se
defintivno restauriše poslije uklanjanja samo podminirane gleđi bez uklanjanja karijesnog dentina (Mertz-
Fairhurst i sar., 1998; Phonghanyudh i sar., 2012), a u drugim poslije uklanjanja gleđi i dijela karijesnog
dentina, ostavljajući vlažne i mekane karijesne mase na dnu kaviteta (Lula i sar., 2009). U najvećem broju
slučajeva, karijesno tkivo se uklanja u tom obimu da na dnu kaviteta ostane tanak sloj oboljelog tkiva
„kožaste“ konzistencije (Casagrande i sar., 2010; Gruythuysen i sar., 2010; Franzon i sar., 2014). Dno
kaviteta se zatim prekriva zaštitnom podlogom na bazi kalcijum hidroksida koja ispoljava antibakterijski
efekat, stimuliše dentinogenezu i remineralizaciju demineralizovanog dentina i kavitet se trajno
restauriše. Dvoseansnu terapiju duboke karijesne lezije karakteriše uklanjanje najvećeg dijela karijesom
izmijenjenog tkiva, i postavljanje zaštitne podloge prije privremenog zatvaranja kaviteta. U drugoj posjeti,
poslije određenog perioda, uklanja se karijesno tkivo u cjelosti, dno kaviteta se prekriva zaštitnom
podlogom (kalcijum hidoksid) i kavitet se trajno restauriše. Brojna klinička, mikrobiološka, radiografska i
laboratorijska ispitivanja su pokazala da karijesni dentin koji ostaje u kavitetu poslije zatvaranja prelazi u
inaktivnu formu, na šta ukazuju klinički nalazi karijesnog dentina koji postaje tvrđi, suvlji i tamnije boje, sa
smanjenim brojem bakterija i povećanom radiografskom gustinom (Lula i sar., 2009; Bjørndal i sar., 2010;
Lula i sar., 2011; Maltz i sar., 2012b). Sa druge strane, smanjenje broja bakterija i zaustavljanje karijesnog
procesa poslije nepotpunog uklanjanja karijesa i restauracije zuba nije zabilježeno u istraživanjima
Weerheijm i sar. (1992) i Wicht i sar. (2004). Kada su poredili uspjeh liječenja dubokog karijesa u jednoj ili
dvije posjete Orhan i sar. (2008) su našli da je poslije 12 mjeseci uspjeh liječenja približno isti (100% vs.
98%). Sa druge strane uspješan ishod liječenja dubokog karijesa u dvije posjete u trogodišnjem
opservacionom periodu je bio znatno manji u odnosu na jednoseansnu terapiju u istraživanju Maltz i sar.
(2012a)(91% vs. 61%). Manji uspjeh liječenja autori povezuju sa većim rizikom od eksponiranja pulpe
tokom uklanjanja karijesa u drugoj posjeti (Maltz i sar., 2012a; Maltz i sar., 2013). Neki autori ukazuju da
UVOD
1.

5
su prednosti jednoseansne terapije u odnosu na dvoseansnu terapiju i ekonomska strana (Schwendicke i
sar., 2013c) i manja neprijatnost samog postupka, jer se liječenje završava u istoj posjeti.
Direktno prekrivanje pulpe je terapijska procedura koje se sprovodi u onim slučajevima kada je uklanjanje
karijesa dovelo do eksponiranja pulpne komore. Otvaranje pulpne komore se obično dešava kao
posljedica uklanjanja karijesnih masa u cjelosti prije postavljanja definitivnog ispuna. Naime, istraživanja
pokazuju da je kompletna ekskavacija karijesnog tkiva u jednoj posjeti u terapiji dubokog karijesa
povezana sa većim rizikom za otvaranjem pulpne komore i pojavom postoperativnih simptoma u
poređenju sa indirektnim jednoseansnim ili dvoseansnim prekrivanjem (Bjørndal i sar., 2010; Schwendicke
i sar., 2013a; Schwendicke i sar., 2013b; Ricketts i sar., 2013; Franzon i sar., 2014). Uspješan ishod
direktnog prekrivanja je mali u onim slučajevima kada je pulpa eksponirana prilikom uklanjanja karijesa
(Al-Zayer i sar., 2003; Bjørndal i sar., 2010). Ovi nalazi kao i rezultati preglednih studija i meta analiza
pokazuju da indirektna terapija dubokog karijesa ima kliničku prednost u poređenju sa kompletnom
ekskavacijom karijesnog dentina (Ricketts i sar., 2006; Hayashi i sar., 2011; Schwendicke i sar., 2013a;
Schwendicke i sar., 2013b; Ricketts i sar., 2013).
Poznato je da se kompletnom ekskavacijom karijesnog tkiva ne uklanjaju sve bakterije iz kaviteta (Maltz i
sar., 2012b). Problem perzistencije bakterija još je veći kod manje invazivnih terapijskih procedura, koje
imaju za cilj maksimalno čuvanje zubne supstance (Maltz i sar., 2002; Maltz i sar., 2012b). Bakterije koje
ostaju poslije ekskavacije karijesa i restauracije kaviteta mogu da perzistiraju i proliferišu i godinu dana
poslije postavljanja ispuna i dovedu do sekundarnog karijesa i oštećenja pulpe (Gu i sar., 2010). Važno je
istaći da ni jedan od dostupnih restaurativnih materijala ne obezbjeđuje adekvatno zaptivanje kaviteta u
dužem vremenskom periodu. Uzimajući ove činjenice u obzir, preporučena je primjena antibakterijskih
supstanci poslije završene preparacije kaviteta a prije postavljanja zaštitnih podloga i definitivnog ispuna
(Wicht i sar., 2004; Pappas i sar., 2005; Polydorou i sar., 2006; Al-Omari i sar., 2006; Müller i sar., 2007; Gu
i sar., 2010; Hosoya i sar., 2010; Shafiei i Memarpour, 2012).

1.4. EFIKASNOST ODONTOANTISEPTIKA U RESTAURATIVNOJ TERAPIJI
Idealan odontoantiseptik u restaurativnoj terapiji bi trebao da, poslije primjene u kavitetu, eliminiše
preostale bakterije, spriječi nastanak sekundarnog karijesa i inflamacije pulpe i da smanji postoperativnu
osjetljivost zuba bez štetnih uticaja na pulpo-dentinski kompleks i kvalitet adhezije restaurativnih
materijala za zubna tkiva.
Odontoantiseptici koji se koriste u restaurativnoj terapiji su hlorheksidin, etilendiaminotetraacetatna
kiselina, natrijum hipohlorit i vodonik peroksid (Shafiei i Memarpour, 2012).
1.4.1. Hlorheksidin
Hlorheksidin, hlorfenil bisgvanid, ispoljava širok spektar djelovanja na Gram pozitivne i na Gram negativne
bakterije, gljivice, dermatofite i neke lipofilne viruse (Jones, 1997). Hlorheksidin smanjuje ukupan broj
kariogenih bakterija, kao i Streptococcus spp. i Lactobacillus spp. i Actinomyces naeslundii (Wicht i sar.,
UVOD
1.

6
2004, Borges i sar., 2012; Kollmuss i sar., 2014). Zbog izraženog efekta na bakterije, hlorheksidin u
kavitetima smanjuje učestalost karijes recidiva i postoperativnu osjetljivost (Siso i sar., 2009). Gram
pozitivne bakterije, kao što su S. mutans i S. sorbinus, koje se povezuju sa nastankom karijesa, su
osjetljivije na djelovanje hlorheksidina od Gram negativnih bakterija (Emilson, 1977). Po nekim autorima
osjetljivost Streptococcus spp. je izraženija u poređenju sa Lactobacillus spp. (van Lunsen i sar., 2000;
Botelho, 2000; Ersin i sar., 2006), dok pojedini nalaze da je hlorheksidin podjednako efikasan protiv oba
roda bakterija (Borges i sar., 2012). Istraživanja pokazuju da hlorheksidin smanjuje broj S. mutans in vitro
(Järvinen i sar., 1993; Turkun i sar., 2006; Kollmuss i sar., 2014) i u kliničkim uslovima u okluzalnim
fisurama, na površini korijena zuba i u karijesnim kavitetima (Fure i Emilson, 1990; Schaeken i sar., 1991;
Ersin i sar., 2006). Hlorheksidin sa pozitivno naelektrisanim azotnim atomima na obje strane
heksametilenskog lanca vezuje se za negativno naelektrisane proteine i fosfolipide ćelijske membrane
bakterija, čime povećava permeabilnost membrane i uzrokuje izlazak intracelularnih komponenti iz ćelije.
U većim koncentracijama ispoljava baktericidno djelovanje koje je posljedica koagulacije citoplazme.
Pozitivno naelektrisana molekula hlorheksidina se sa visokim afinitetom vezuje i za druge negativno
naelektrisane površine u usnoj duplji, kao što su gleđ, dentin i oralna mukoza što znatno doprinosi
njegovoj adsorptivnosti i produženom antibakterijskom djelovanju.
Pored antibakterijskog djelovanja, hlorheksidin u kavitetima inhibira metaloproteinaze (MMP), MMP-2,
MMP-8 i MMP-9 što sprječava degradaciju kolagena u hibridnom sloju in vivo i in vitro (Ricci i sar., 2010;
Lindblad i sar., 2012). Takođe, kada se primjeni u obliku vodenog rastvora, hlorheksidin može da rehidrira
suv mineralizovani dentin održavajući eksponiranu mrežu kolagena (Soares i sar., 2008). Naime, kolagen
predstavlja neophodnu komponentu za vezivanje kompozitnih materijala za dentin. Istraživanja pokazuju
da hlorheksidin, bilo da se primjeni prije ili poslije kiselinskog nagrizanja dentina, nema uticaj na kvalitet
veze adhezivnih sistema za dentin i kvalitet zaptivanja (Chang i Shin, 2010; Celik i sar., 2010). Međutim, u
određenim situacijama, hlorheksidin može da smanji jačinu veze materijala za dentin i poveća
mirkocurenje (Pappas i sar., 2005; Saber i El-Askary, 2009; Siso i sar., 2009; Ercan i sar., 2009). Meiers i
Kresin (1996) su pokazali da hlorheksidin stvara sloj koji je otporan na kiselinsko nagrizanje što može da
smanji penetraciju hidrofilne smole u dentin. Takođe, hlorheksidin koji zaostaje u kavitetu poslije
primjene može da interreaguje sa kalcijumovim i fosfatnim jonima i tako smanji jačinu veze (Vieira i da
Silva, 2003). Hlorheksidin ne utiče na tvrdoću dentina (Aslantas i sar., 2014), osim u slučajevima
produženog djelovanja (Oliveira i sar., 2007). Dugotrajna primjena hlorheksidina može biti povezana i sa
nekim drugim neželjenim efektima kao što su: prebojavanje zuba, poremećaj ukusa, stvaranje
supragingivalnih konkremenata, u rjeđim slučajevima erozije sluznice, usporeno zarastanje rana i vrlo
rijetko uvećanje parotidne pljuvačne žlijezde (Dumitrescu, 2011). Ovi neželjeni efekti nisu izraženi kada se
koristi u toku restaurativnog zahvata za dezinfekciju kaviteta, zbog kratkotrajnog djelovanja.
Hlorheksidin ima malu toksičnost koja nije ćelijski specifična (Giannelli i sar., 2008; Bernardi i Teixeira,
2015). Zabilježena je negova citotoksičnost na humane gingivalne fibroblaste, ćelije oralnog epitela, ćelije
periodontalnog ligamenta, ćelije alveolarne kosti i osteoblastne ćelije (Mariotti i Rumpf 1999; Huth i sar.,
2006; Almazin i sar., 2009; Lee i sar., 2010). Smatra se da je ovaj efekat zavisan od primjenjene doze i
vremena djelovanja (Gomes i sar., 2013; Bernardi i Teixeira, 2015). Citotoksičan efekat hlorheksidina
zavisan od primjenjene koncentracije (0,0024%, 0,004% i 0,02%) na ćelije koje liče na odontoblaste
UVOD
1.

7
pokazan je i u studiji de Souza i sar. (2007). Oblik primjenjenog lijeka i sastav medijuma na koji
hlorheksidin djeluje takođe determinišu citotoksično djelovanje (Babich i sar., 1995; Gomes i sar., 2013;
Bernardi i Teixeira, 2015).

1.4.2. Etilendiaminotetraacetatna kiselina
Etilendiaminotetraacetatna kiselina (EDTA) ima slab antibakterijski efekat. Može da smanji broj crno
obojenih Gram negativnih anaerobnih bakterija i nekih fakultativnih anaerobnih bakterija, bez uticaja na
Gram pozitivne bakterije (Siqueira i sar.,1998; Grawehr i sar., 2003). Zabilježen je i antifugalni efekat ovog
sredstva (Ballal i sar., 2011). EDTA predstavlja helator kacijumovih jona, ali i jona magnezijuma, mangana i
cinka, koji su važni u morfogenezi, adherenciji i rastu gljivica (Ates i sar., 2005; Ballal i sar., 2011). Pojedini
autori smatraju da smanjenje broja bakterija poslije primjene EDTA nastaje zbog njegovog efekta na
razmazni sloj prije nego antiseptičkog djelovanja (Di Lenarda i sar., 2000). Zbog izraženog helatnog
djelovanja, odnosno oslobađanja kalcijumovih jona i dekalcifikacije dentinskog tkiva, kao i rastvaranja
organskih komponenti dentina (Beltz i sar., 2003; Nishitani i sar., 2005) EDTA se koristi za uklanjanje
razmaznog sloja u restaurativnoj terapiji.
EDTA smanjuje mikrotvrdoću dentina (Eldeniz i sar., 2005; Aslantas i sar., 2014). Nygaard-Ostby (1957) je
ispitivao uticaj 15% EDTA na humanu pulpu i periapeksno tkivo zuba sa vitalnom i nekrotičnom pulpom.
Rezultati tog istraživanja pokazali su da EDTA ne dovodi do oštećenja periapeksnog tkiva 14 mjeseci
poslije iniciranja u periapeksno tkivo, kao i da njegova primjena u trajanju od 28 dana ne dovodi do
nekroze pulpe poslije pulpotomije. U komercijalnim preparatima za dezinfekciju kaviteta u kombinaciji sa
kvaternernim jedinjenjima amonijaka (Tubilicid), EDTA eliminiše bakterije iz kaviteta prije postavljanja
ispuna bez štetnog djelovanja na pulpu (Brannstrom i Nyborg, 1973). Druga istraživanja ukazuju na njen
izražen citotoksični efekat. Zabilježen je citotoksični efekat EDTA na fibroblaste i makrofage koji je dozno
zavisan (Sousa i sar., 2005; Amaral i sar., 2007; Ballal i sar., 2009). Kada se primjeni u tkivo dovodi do
izražene iritacije, koja može biti prisutna i 28 dana poslije primjene (Segura i sar., 1996, Segura i sar., 1997;
Zaccaro Scelza i sar., 2010).

1.4.3. Natrijum hipohlorit
Natrijum hipohlorit (NaOCl) ispoljava širok spektar nespecifičnog djelovanja na bakterije, spore i viruse
(McDonnell i Russell, 1999). Istraživanja pokazuju da ovaj antiseptik djeluje na kariogene bakterije: S.
mutans, S. sorbinus i Lactobacillus acidophilus (Ergücü i sar., 2005). Antibakterijski efekat se pripisuje
oslobađanju hidroksilnih jona i hlora, koji dovode do ireverzibile oksidacije sulfhidrilnih grupa esencijalnih
bakterijskih enzima.
Pored antiseptičkog dejstva, natrijum hipohlorit takođe rastvara organsko i nekrotično tkivo jer
transformiše masne kiseline i masti u soli (sapun) i glicerol (alkohol). Može da se primjeni i kao hemostatik
kod direktnog prekrivanja pulpe i vitalne amputacije (Hafez i sar., 2002). Natrijum hipohlorit rastvara
kolagen, magnezijumove i fosfatne jone iz dentina dok povećava nivo karbonata i negativno utiče na
UVOD
1.

8
mehaničke karakteristike dentina: tvrdoću, modul elastičnosti i otpornost na savijanje (Pascon i sar., 2009;
Aslantas i sar., 2014). Zbog djelovanja na organske komponente dentina, može da remeti stvaranje
hibridnog sloja u kavitetima i negativno utiče na kvalitet veze adhezivnih sistema za dentin i smanji
marginalno zaptivanje kompozitnih restauracija (Erdemir i sar., 2004; Pappas i sar., 2005; Saber i El-
Askary, 2009; Ercan i sar., 2009), ali taj efekat zavisi od vrste primjenjenog adheziva (Shinohara i sar.,
2004; Shafiei i Memarpour, 2012). Prisustvo radikala porjeklom iz proteina hloramina natrijum hipohlorita
može da dovede do preranog završetka polimernog lanca i nepotpune polimerizacije kompozitnih smola
(Lai i sar., 2001). Neželjena svojstva natrijum hipohlorita su i neprijatan miris i ukus i izražena toksičnost
na oralna tkiva, gingivalne fibroblaste i oralne epitelne ćelije (Barnhart i sar., 2005; Huth i sar., 2006).
Smanjenjem koncentracije i dužine djelovanja smanjuje mu se toksičnost, ali i antibakterijski efekat i
efekat rastvaranja tkiva (Mohammadi, 2008; Alkahtani i sar., 2014).

1.4.4. Vodonik peroksid
Vodonik peroksid djeluje na veliki broj mikroorganizama: bakterije, gljivice, viruse i spore (McDonnell i
Russell, 1999). Bakterije koje ne pokazuju katalaznu aktivnost, kao što su Streptococcus spp. i Lactobacillus
spp., posebno su osjetljive na djelovanje ovog antiseptika (Turkun i sar., 2006; Ikai i sar., 2010).
Antibakterijski efekat se zasniva na djelovanju hidroksilnih radikala koji, kao jaki oksidansi, lako reaguju sa
makromolekulima kao što su DNK i lipidi u membrani ćelija i dovode do smrti ćelije.
Pored antiseptičkog, vodonik peroksid ima i dezodorantno dejstvo, jer uklanja i oksidiše organske materije
neprijatnog mirisa, hemostatičko djelovanje, jer taloži fibrinogen, a zbog naglog oslobađanja kiseonika i
stvaranja obilne pjene mehanički uklanja ostatke tkiva. Sposobnost vodonik peroksida da oksidiše
organske komponente zubnih tkiva, koristi se za bijeljenje zuba. To djelovanje nije povezano sa
promjenama u proteinskom i mineralnom sastavu gleđi i dentina (Eimar i sar., 2012) iako su nalazi o
uticaju sredstava za biljeljenje zuba na mehaničke karakteristike zubnih tkiva često različiti i kontradiktorni
(Ittatirut i sar., 2014). Kiseonik oslobođen iz vodonik peroksida inhibira polimerizaciju adhezivnih sistema
(Nikaido i Nakabayashi, 1988; Torneck i sar., 1990, Cadenaro i sar., 2006), i negativno utiče na kvalitet
veze ovih sistema za dentin (Erdemir i sar., 2004; Ercan i sar., 2009) kao i na fizičke karakteristike
kompozitnih materijala (Gurgan i Yalcin Cakir, 2008). Neželjeni efekti koji mogu da se jave usljed primjene
vodonik peroksida su ulceracije mukoze (Rees i Orth, 1986) i patološke promjene vezane za pre-
neoplastične lezije (Weitzman i sar., 1986). Vodonik peroksid ispoljava citotoksičan efekat na gingivalne
fibroblaste i oralne epitelne ćelije (Huth i sar., 2006). Zbog male molekulske mase, vodonik peroksid i
njegovi produkti mogu lako da difunduju kroz zubna tkiva i uzrokuju oksidativni stres u pulpnim ćelijama i
ćelijsku smrt (Soares i sar., 2014a; Soares i sar., 2014b). Taj efekat je dozno i vremenski zavisan.

1.4.5. Druga sredstva sa antiseptičkim djelovanjem
Zanimljivo je istaći da u savremenoj restaurativnoj stomatologiji postoji tendencija da se u sastav
kompozitnih smola i glas jonomer cemenata dodaju različite supstance sa antibakterijskim djelovanjem.
UVOD
1.

9
Iako mogu djelovati na bakterije u karijesnim kavitetima, ove supstance istovremeno utiču i na mehaničke
karakteristike i vezivanje materijala za zubna tkiva (Imazato, 2003; Li i sar., 2009). Problemi vezani za ove
materijale su kontrola kinetike oslobađanja antimikrobne supstance i obezbjeđivanje protrahovanog
antibakterijskog efekta (Imazato, 2003; Li i sar., 2009).
Interesantan je podatak da su sintetisani monomeri koji omogućavaju dugotrajan antibakterijski efekat
adheziva i kompozitnih materijala i poslije njihovog postavljanja u kavitet, bez oslobađanja aktivnih
supstanci. Ispoljavaju kontaktni inhibitorni efekat na bakterije izolovane iz karijesnih lezija krunice i
korijena (Imazato i sar., 2001; Imazato, 2003; Korkmaz i sar., 2008), a poslije polimerizacije inhibiraju
adherenciju i rast bakterija na svojoj površini. Dodavanje ovih monomera ne remeti vezivanje materijala
za zubna tkiva, ne utiče na kvalitet polimerizacije, marginalnu adaptaciju i citotoksičnost materijala nosača
antibakterijske supstance (Bortolotto i sar., 2007; Imazato i sar., 2007).
Postoje podaci da se dezinfekcija kaviteta može postići i primjenom lasera (Klinke i sar., 1997). Energija
lasera može da se koristi samostalno (Walsh i sar., 2003; Xia i sar., 2012) ili mogu da se kombinuju sa
fotosenzitivnim supstancama za eliminaciju bakterija u karijesnim lezijama (Walsh i sar., 2003; Lima i sar.,
2009). Tretiranje kaviteta laserom ne utiče na vezivanje adheziva za zubna tkiva, ali je sam postupak
primjene kompleksan i ekonomski je zahtjevniji oblik terapije u poređenju sa drugim dostupnim
metodama dezinfekcije (Siso i sar., 2009).

1.5. OZON KAO ODONTOANTISEPTIK
Ozon je našao široku primjenu u medicini gdje se koristi u terapiji očnih oboljenja, akutnih i hroničnih
oboljenja izazvanih bakterijama, virusima i gljivicama, ishemičnih oboljenja, starenjem uzrokovane
makularne degeneracije, oboljenja koštanog sistema, kožnih, plućnih, bubrežnih i neurodegenerativnih
oboljenja i oboljenja hematopoeznog organa. Poslednjih godina ozon se kao antiseptik primjenjuje i u
stomatologiji zbog izraženog djelovanja na bakterije, viruse, gljivice i protozoe, bez pojave antimikrobne
rezistencije (Paraskeva i Graham, 2002).
U in vitro uslovima ozon primjenjen u obliku gasa efikasno djeluje na kariogene bakterije: S. mutans, L.
casei, Lactobacillus paracasei, A. neaslundii (Polydorou i sar., 2006; Castillo i sar., 2008; Johansson i sar.,
2009; Polydorou i sar., 2012; Kollmuss i sar., 2014). Takođe, ozon pokazuje efikasnost na bakterije koje se
nalaze u primarnim karijesnim lezijama korijena zuba (Baysan i sar., 2000; Baysan i Lynch, 2004). Njegova
efikasnost u kliničkim uslovima ispitivana je u malom broju studija, a dobijeni rezultati su oprečni. Pojedini
autori nalaze da ovaj antiseptik dovodi do smanjenja broja kariogenih bakterija u karijesnim kavitetima
(Bysan i Lynch, 2007; Dukić i sar., 2013) dok drugi nisu zabilježili njegov antibakterijski efekat (Hauser-
Gerspach i sar., 2009).
Sa kliničkog aspekta značajni su radovi u kojima je ispitivan efekat ozona na kliničke parametre karijesa.
Holmes i sar. (2003) su pokazali da je ozon, uz primjenu remineralizacionih sredstava (pasta, vodica za
ispiranje i sprej) u opservacionom periodu od 18 mjeseci doveo do značajnog zaustavljanja karijesnih lezija
UVOD
1.

10
korijena. Slično, Baysan i Lynch (2007) su zapazili da oko 51% karijesnih lezija korijena očvršćava 6 mjeseci
poslije terapije ozonom. U nekoliko studija je ispitivan efekat ozona na okluzalni karijes kod djece i
adolescenata u opservacionom periodu od 3 mjeseca (Huth i sar., 2005), 6 mjeseci (Atabek i Oztas, 2011),
8 mjeseci (Dähnhardt i sar., 2006) i 12 mjeseci (Johansson i sar., 2014). Rezultati ukazuju da ozon dovodi
do zaustavljanja karijesa i progresije oboljenja, ali ne u svim slučajevima (Johansson i sar., 2014). Uočeno
je da kod početnih aproksimalnih karijesnih lezija, 18 mjeseci poslije primjene gasnog ozona, dolazi do
uklanjanja bakterija iz spoljašnjih djelova lezije i zaustavljanja demineralizacije, ali bez njegovog uticaja na
dublje slojeve (Yazıcıoğlu i Ulukapi, 2014).
Po nekim autorima antimikrobno djelovanje ozon ostvaruje na dva načina: direktnim djelovanjem
molekularnog ozona ili preko reaktivnih produkata koji nastaju njegovim razlaganjem, kao što su
hidroksilni anjon (OH-), superoksidni anjon (O2-), perhidroksiradikal (HO2-) (Khadre i sar., 2001).
Nespecifičnim mehanizmom ozon oštećuje ćelijski zid i citoplazmatsku membranu bakterijskih ćelija.
Naime, oksidacijom glikoproteina, glikolipida i drugih aminokiselina inhibira i blokira enzimsku kontrolu
ćelije i dovodi do povećanja ćelijske permeabilnosti i smrti ćelije. Takođe, ozon može da reaguje sa
brojnim biomolekulima koje sadrže cistein, metionin i histidin. Ćelijska smrt usljed dejstva ozona može da
nastane i zbog oštećenja enzima i nukleinskih kiselina u citoplazmi mikrobne ćelije (Khadre i sar., 2001;
Azarpazhooh i Limeback, 2008).
Antibakterijski efekat ozona zavisi od nekoliko faktora: primjenjene doze, dužine primjene, prisustva
organskog sadržaja, bakterijske vrste na koje djeluje, temperature sredine i pH. Još uvijek ne postoje
standardizovani protokoli primjene ozona u restaurativnoj proceduri u pogledu dužine primjene i
potrebne doze. Istraživanja pokazuju da se sa povećanjem dužine primjene povećava i efikasnost, a da
doze ozona na mjestu aplikacije variraju od primjenjenog generatora ozona. U in vitro studiji Castillo i sar.
(2008) su pokazali da poslije primjene ozona u trajanju od 10, 20 i 40 sekundi na S. mutans izolovan iz
karijesnih lezija djece sa visokim rizikom za nastanak karijesa, ozon značajno redukuje ove bakterije poslije
10 i 20 sekundi, a potpuno uništava poslije 40 sekundi. Tuncer i sar. (2013) i Kollmuss i sar. (2014) nalaze
da se sa povećanjem doze i dužine djelovanja povećava antiseptički efekat ozona na oralne bakterije.
Prisustvo organskog sadržaja smanjuje ozonsku efikasnost. Pljuvačka i dentalni plak, kao organski
supstrati, u kliničkim uslovima reaguju sa ozonom smanjujući količinu dostupnog ozona za interakciju sa
bakterijama. Takođe, bakterije organizovane u biofilmove imaju manju metaboličku aktivnost i otpornije
su na djelovanje antiseptika od bakterija koje se nalaze u planktonskom obliku, a polimerni matriks
biofilma sprječava difuziju antibakterijskih supstanci (Lima i sar., 2009). Johansson i sar. (2009) su u in
vitro studiji pokazali da pljuvačka smanjuje efikasnost ozona na kariogene bakterije i da se inhibitroni
efekat pljuvačke gubi sa produžavanjem djelovanja. Müller i sar. (2007) su u svojoj in vitro studiji pokazali
na ograničen antiseptički efekat ozona na različite bakterijske vrste organizovane u kariogene biofilmove,
dok, sa druge strane, Nagayoshi i sar. (2004) nalaze izraženi antibakterijski efekat ozonirane vode na
bakterije u eksperimentalnom i humanom dentalnom plaku. U pogledu osjetljivosti pojednih vrsta
mikroorganizama na ozon postoji veoma malo slaganja među istraživačima. Takođe, osjetljivost pojedinih
vrsta se razlikuje između studija. Vrsta, starost bakterijske kulture, broj bakterija, način primjene ozona,
način mjerenja efekta neki su od faktora koji otežavaju komparaciju između studija. Uočeno je da su na
djelovanje ozona manje osjetljive Gram pozitivne bakterije u odnosu na Gram negativne, kao i aerobne u
UVOD
1.

11
poređenju sa anaerobnim bakterijama. Jedan od razloga manje osjetljivost Gram pozitivnih bakterija u
poređenju sa Gram negativnim je veća koncentracija peptidoglikana u ćelijskom omotaču koji je relativno
rezistentan na djelovanje ozona. Ozon efikasnije djeluje na obligatne anaerobne bakterije, zbog njihove
intolerancije na prisustvo kiseonika. Sa druge strane, on može predstavljati donator kiseonika za aerobne i
fakultativno aerobne bakterije koje ga koriste za rast (Bezirtzoglou i sar., 2008) tako da je djelovanje ozona
na ove vrste ograničeno, posebno kada se primjeni u nižim koncentracijama. Uticaj temperature na
efikasnost ozona se ogleda u smanjenju rastvorljivosti i stabilnost, a povećanju reaktivnosti sa supstratom
sa povećavanjem temperature. Na smanjenje stabilnosti ozona utiče i povećanje alkaliteta, iako se smatra
da pH u opsegu od 5,7-10,1 nema uticaj na njegovo djelovanje (Khadre i sar., 2001).
Pored antimikrobnog, ozon ispoljava i druge značajne efekte na zubna tkiva. Interesantan je podatak da
primjena ozona na nekarijesni dentin sprječava stvaranje biofilmova S. mutans i L. acidophilus na površini
zuba u trajanju od četiri nedjelje (Knight i sar., 2008). Sličan efekat ozona na sprječavanje stvaranja
dentalnog plaka zabilježili su Nagayoshi i sar. (2004) primjenom ozonirane vode na površini
dekalcifikovanih zuba. Postoje podaci koji ukazuju da oksidativnim djelovanjem ozon može da stimuliše
remineralizaciju demineralizovanog dentina (Baysan i Lynch, 2004). Djelovanjem na bakterije koje se
nalaze u karijesnoj leziji ozon dovodi do promjene sredine iz acidogene u onu koja pospješuje procese
remineralizacije. Takođe, pirogrožđanu kiselinu, jednu od najjačih prirodnih kiselina koju stvaraju
bakterije, ozon dekarboksiluje u acetatnu kiselinu i ugljen dioksid. Stvaranje ove i drugih kiselina sa
visokim pKa u plaku može da utiče na neutralizaciju plaka i procese remineralizacije početnih karijesnih
lezija. Ozon reaguje i sa organskim materijama u karijesnim lezijama čime omogućava penetraciju
kalcijumovih i fosfatnih jona kroz leziju, što pospješuje remineralizaciju (Tahmassebi i sar., 2014). Ipak, in
vitro studije pokazuju da kada se primjeni samostalno, ozon ne sprječava demineralizaciju niti pospješuje
remineralizaciju dentina (Zaura i sar., 2007; Tahmassebi i sar., 2014), ali i ne potencira procese
demineralizacije sveže remineralizovanih dentinskih lezija, kao što je to zabilježeno za natrijum hipohlorit
(Zaura i sar., 2007). U kombinaciji sa supstancama koje stimulišu remineralizaciju, ozon ne ispoljava
značajan efekat na smanjenje demineralizacije tvrdih zubnih tkiva in situ (Duggal i sar., 2012). Ipak, treba
uzeti u obzir ograničenja in vitro istraživanja i odsustvo reakcije vitalne komponente pulpo-dentinskog
kompleksa na djelovanje ozona, uzimajući u obzir ulogu pulpe u procesima remineralizacije i
dentinogeneze. Za razliku od drugih oksidativnih supstanci, ozon ne remeti vezivanje adhezivnih sistema
za zubna tkiva, čak i povećava jačinu veze, i smanjuje mikrocurenje (Schmidlin i sar., 2005; Cadenaro i sar.,
2009; Magni i sar., 2011; Kapdan i Oztas i sar., 2015). Takođe, ozon ne utiče na mikromehaničke
karakteristike gleđi (Celiberti i sar., 2006), dentina (Magni i sar., 2010) i kompozitnih materijala (Magni i
sar., 2011).
Interesantno je pomenuti da ozon ispoljava i druge farmakodinamske efekte na tkiva. Naime, poboljšava
protok krvi i dopremanje kiseonika u tkiva, što dovodi do aktiviranja ćelijskih aerobnih procesa i
metabolizma u tkivima. Ozon povećava sintezu antioksidativnih enzima i umjereno aktivira imuni sistem i
stimuliše oslobađanje faktora rasta, NO sintaze i aktivira stem ćelije (Bocci, 2005; Sagai i Bocci, 2011;
Gupta i Mansi, 2012)

UVOD
1.

12
1.6. PRINCIPI ISPITIVANJA BEZBJEDNOSTI ODONTOANTISEPTIKA
Odontoantiseptici su sredstva koja se primjenjuju lokalno za dezinfekciju kaviteta zuba poslije preparacije
kaviteta (sredstva za ispiranje kaviteta) ili za ispiranje i dezinfekciju kanala korijena zuba poslije
endodontskog liječenja (intrakanalni irigansi i medikamenti).
Za odontoantiseptike, kao i druge stomatološke materijale koji se takođe primjenjuju lokalno na oralna
tkiva, od značaja je njihov farmakodinamski efekat, kao i njihov bezbjednosni profil tj. potencijalni rizik da
oštete zubna ili oralna tkiva sa kojima dolaze u kontakt. Dva važna fenomena citotoksičnost i
biokompatibilnost određuju bezbjednosni profil dentalnih materijala (uključujući i odontoantiseptike) ili
šire stomatoloških materijala. Citotoksičnost predstavlja molekularne promjene koje dovode do oštećenja
ćelija (Aldridge, 1993). Biokompatibilnost predstavlja reakciju na primjenjeni materijal od strane tkiva ili
cijelog organizma (van Loon i Mars, 1997). Preporučeni protokol Međunarodne organizacije za
standardizaciju (ISO) za ispitivanje citotoksičnosti i biokompatibilnosti dentalnih materijala uključuje i
njihovo poređenje sa pozitivnom i negativnom kontrolom (ISO 10993, 1992; ISO 7405, 1996). Pomenuti
ISO protokol ima četiri faze: u prvoj fazi citotoksični efekti materijala se mjere u in vitro uslovima na
jednoslojnim ćelijskim kulturama što omogućuje dobru reproduktivnost rezultata (Schmalz, 1988; Schmalz
i sar., 1996). Materijali koji u ovim testovima pokažu mali nivo citotoksičnosti se dalje implantiraju u male
laboratorijske životinje, obično glodare, i porede sa kontrolama čime se dobijaju in vivo citotoksične i
biokompatibilne karakteristike (ISO 10993, 1992; ISO 7405, 1996). Materijali koji pokažu dobru
komplijansu u ovim in vivo testovima postavljaju se u kavitete V klase zuba primata, ne računajući humani
model, uz primjenu kontrole, uslovi koji imitiraju restaurativnu proceduru za ispitivanje biokompatibilnosti
i citotoksičnosti (Cox i sar., 1987; Cox i sar., 1998). Poslije ovih testova zubi se ekstrahuju i histološki
ispituju. Ukoliko zubna tkiva pokažu nizak nivo ćelijskih oštećenja zajedno sa odsutnim ili minimalnim
stepenom zapaljenja smatra se da je materijal prošao ISO zahtjeve i može se primjeniti u ispitivanjima na
pacijentima (ISO 10993, 1992; ISO 7405, 1996). Razumije se da su rezultati o bezbjednosnom profilu
dentalnog materijala dobijeni u kliničkim studijama najvalidniji. Ove kliničke studije mogu biti dizajnirane
kao retrospektivne, studije presjeka, prospektivne uz randomizaciju, kao kontrolisana studija, po
mogućnosti primjenom jednostruko ili dvostruko slijepe metode.
Iako je antimikrobni efekat ozona procjenjivan u brojnim istraživanjima, samo u nekoliko studija je
ispitana biokompatibilnost ovog antiseptika sa oralnim tkivima. Tako na primjer, Huth i sar. (2006) su
pokazali u in vitro studiji na kulturama humanih ćelija oralnog epitela i gingivalnih fibroblasta da ozon,
primjenjen u obliku gasa, ispoljava citotoksičan efekat na ćelije, dok primjenjen kao ozonirana voda
ispoljava optimalnu biokompatibilnost. U istoj studiji autori su uporedili biokompatibilnost ova dva oblika
ozona sa najčešće primjenjivanim oralnim antisepticima: hlorheksidinom, natrijum hipohloritom i vodonik
peroksidom. Ozonirana voda ne ispoljava toksičan efekat na humane ćelije oralnog epitela i gingivalne
fibroblaste, dok je efekat gasnog ozona u rangu ili čak manji od onog koji je zabilježen za 2% hlorheksidin,
2,25% i 5,25% natrijum hipohlorit i 3% vodonik peroksid (Huth i sar., 2006). Druga studija je takođe
pokazala biokompatibilnost ozonirane vode na kulture ćelija fibroblasta (Nagayoshi i sar., 2004) i
odontoblasta (Noguchi i sar., 2009). Ozon primjenjen kao ozonirani medijum (ozonirana voda bez fetalnog
seruma) u kulturi humanih oralnih epitelnih ćelija, gingivalnih fibroblasta i HeLa ćelija inhibira nuklearni
UVOD
1.

13
faktor kapa B (NF-kB), oslobođen pod uticajem faktora nekroze tumora (Huth i sar., 2007). U istom
istraživanju inhibitorni efekat ozoniranog medijuma na NF-kB je zabilježen i u periodontalnom ligamentu
parodontološki kompromitovanih zuba. Ovi rezultati ukazuju na antiinflamatorni i imunomodulatorni
potencijal ozona (Huth i sar., 2007).
Ozon predstavlja jako oksidativno sredstvo i njegovo je razlaganje praćeno oslobađanjem vodonik
peroksida i drugih reaktivnih vrsta kiseonika (engl. Reactive oxygen species (ROS)). ROS predstavljaju
produkte metabolizma kiseonika u fiziološkim uslovima i imaju značajnu ulogu u signalnim ćelijskim
procesima, proliferaciji ćelija i ćelijskom preživljavanju. Pretjerano stvaranje ROS dovodi do oštećenja
ćelijskih struktura, stanja poznatog kao oksidativni stres koji se povezuje sa nastankom brojnih oboljenja
(Valko i sar., 2007; Buczko i sar., 2015). Odbrambeni mehanizmi protiv oksidativnog stresa
podrazumijevaju: preventivne i reparatorne mehanizme, fiziološku odbranu i antioksidativnu zaštitu
(Valko i sar., 2007). Antioksidativnu zaštitu čine neenzimski antioksidansi, kao što su askorbinska kiselina,
α-tokoferol, glutation, karetenoidi, flavonoidi, i enzimski antioksidansi, kao što su glutation peroksidaza
(GPx), katalaza (CAT) i superoksid dismutaza (SOD) (Valko i sar., 2007). SOD je jedan od najvažnijih
antioksidativnih enzima koji reaguje sa ROS, posebno sa superoksidnim anjonskim radikalom stvarajući
vodonik peroksid i kiseonik (Davis i sar., 1991). Razlikuju se tri izoforme ovog enzima: citosolna Cu, Zn
SOD, mitohondrijalna Mn-SOD i ekstraćelijska SOD. Ovaj oksidativni enzim je nađen u zdravom tkivu pulpe
(Davis i sar., 1991; Bödör i sar., 2007). Prisustvo SOD u zubnoj pulpi ukazuje na njen biološki zaštitni
mehanizam protiv ROS nastalih tokom inflamacionih promjena (Davis i sar., 1991; Bödör i sar., 2007).
Varvara i sar. (2012) su uočili da preparacija kaviteta povećava nivo SOD. Do sličnih nalaza su došli i
Baumgardner i sar. (1999) koji su još ukazali da je SOD rani i osjetljivi indikator inflamatornog stresa u
pulpi. Povećanje nivoa SOD je zabilježeno i u tkivu ireverzibilno infamirane pulpe (Davis i sar., 1991; Bödör
i sar., 2007). Takođe je uočeno da u toku inflamacije različite forme izoenzima SOD, Cu, Zn SOD i Mn-SOD
pokazuju različitu ekspresiju, što možda predstavlja jedinstvenu karakteristiku inflamacione reakcije u
pulpnom tkivu (Bödör i sar., 2007). Sa druge strane, Varvara i sar. (2005) ukazuju ne na povećanje već na
smanjenje SOD u ireverzibilno inflamiranoj pulpi. Ovo smanjenje autori povezuju sa progresijom
inflamacije u pulpi koja je dovela do trošenja i razgradnje SOD. Uzimajući u obzir da je SOD glavni enzimski
odbrambeni mehanizam protiv toksičnih ROS koje nastaju tokom normalnog oksidativnog metabolizma i
tokom inflamacije (Davis i sar., 1991; Varavara i sar., 2012) i na osnovu prikazanih istraživanja može se
smatrati da je jedan od načina za mjerenje biokompatibilnosti odontoantiseptika, u odnosu na pulpno
tkivo, ispitivanje njihovog uticaja na SOD u zubnoj pulpi.
Faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF) ima značajnu ulogu u razvoju tkiva, ćelijskoj migraciji, inflamaciji
i reparaciji (Mantellini i sar., 2006). VEGF potencira proces neovaskularizacije kako iz postojeće kapilarne
mreže (angiogeneza), tako i de novo (vaskulogeneza) u fiziološkim i patološkim uslovima što čini da je ovaj
faktor rasta kritična komponenta za rast i reparaciju tkiva i organa. Pored toga što djeluje na vaskularne
endotelne ćelije, uočeno je da je VEGF multifunkcionalni signalni faktor koji ostvaruje brojne biološke
efekte djelujući i na druge ćelije (Byrne i sar., 2005). Ćelije zubne pulpe ljudi spontano stvaraju VEGF
(Artese i sar., 2002; Tran-Hung i sar., 2008), a u pulpi se nalaze receptori za VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2 i
VEGFR-3 (Matsushita i sar., 1999; Grando Mattuella i sar., 2007, Virtej i sar., 2013). Matsushita i sar.
(2000) su pokazali da VEGF stimuliše proliferaciju pulpnih ćelija i povećava nivo alkalne fosfataze važne za
UVOD
1.

14
procese biomineralizacije. Ova i druga istraživanja ukazuju da VEGF, pored uloge u angiogenezi koja
prethodi formiranju reparatornog dentina, ima direktan uticaj na diferencijaciju odontoblasta i njihovu
aktivnost (Matsushita i sar., 2000; Scheven i sar., 2008). Povećan nivo VEGF u odontoblastima i
fibroblastima je zabilježen kod zuba sa nezavršenim u odnosu na zube sa završenim rastom korijena, što
ukazuje na ulogu VEGF u maturaciji zuba (Wang i sar., 2007). Različita patološka stanja mogu dovesti do
promjena u nivou VEGF. Artese i sar. (2002) su ispitujući ireverzibilno promjenjene i zdrave pulpe uočili da
je u pulpama sa ireverzibilnim zapaljenjem nivo VEGF povećan u ćelijama koje čine inflamacioni infiltrat,
ali smanjen u stromalnim ćelijama pulpe. Bakterije i njihovi produkti, lipopolisaharid i lipoteihoična
kiselina, indukuju povećanje VEGF u ćelijama zubne pulpe (Matsushita i sar., 1999; Soden i sar., 2009).
Veći nivo VEGF u ćelijama pulpe je zabilježen poslije povrede (Tran-Hung i sar., 2008) i stanjima hipoksije
(Aranha i sar., 2010), kao i u tkivu pulpe, odontoblastima i makrofagima poslije primjene 2-hidroksi-etil
metakrilata (HEMA) (Mantellini i sar., 2006; Tran-Hung i sar., 2008). Uzimajući u obzir da VEGF daje
značajne informacije o vitalnosti i funkcionalnosti ćelija (Paranjpe i sar., 2007) može se koristi za
određivanje biokompatibilnosti odontoantiseptika u odnosu na pulpno tkivo.

15
R A D N A   H I P O T E Z A

2.
RADNA HIPOTEZA
2.

16
2. RADNA HIPOTEZA

Primjena ozona u trajanju od 40 sekundi na duboku karijesnu leziju značajno smanjuje ukupan broj
bakterija i Lactobacillus spp. u karijesnim kavitetima. Istovremeno, ozon povećava nivo VEGF i SOD u
zubnoj pulpi.

17
C I LJ E V I    I S T R A Ž I V A NJ A

3.
CILJEVI ISTRAŽIVANJA
3.

18
3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Imajući u vidu činjenicu da se najveći broj do sada objavljenih studija o antibakterijskoj efikasnosti ozona
na kariogene bakterije odnosi na rezultate dobijene u in vitro studijama i sa druge strane činjenicu da
postoji mali broj radova koji se odnose na biokompatibilnost ozona na zubnu pulpu u in vivo uslovima
postavljeni su sljedeći ciljevi:

1. Ispitati antibakterijski efekat primjene ozona i hlorheksidina, pojedinačno na ukupan broj bakterija i
Lactobacillus spp. u karijesnim kavitetima poslije nepotpunog uklanjanja karijesa.
2. Ispitati antibakterijski efekat primjene ozona i hlorheksidina pojedinačno na pojedine vrste
Lactobacillus spp. u karijesnim kavitetima poslije nepotpunog uklanjanja karijesa.
3. Uporediti antibakterijsku efikasnost ozona i hlorheksidina u karijesnim kavitetima poslije nepotpunog
uklanjanja karijesa.
4. Odrediti koncentraciju VEGF i SOD u zubnoj pulpi poslije primjene ozona na otvorene dentinske
kanaliće u ispreparisanim kavitetima intaktnih zuba koji su iz protetskih razloga indikovani za devitalizaciju
ili iz ortodontskih razloga za ekstrakciju i uporediti sa koncentracijom VEGF i SOD u zubnoj pulpi intaktnih
zuba koji su iz protetskih razloga indikovani za devitalizaciju ili iz ortodontskih razloga za ekstrakciju.

19
M A T E R I J A L   I   M E T O D E

4.
MATERIJAL I METODE
4.

20
4. MATERIJAL I METODE

4.1. DIZAJN STUDIJE
Ispitivanje predstavlja interventnu randomizovanu kontrolisanu kliničku studiju. Istraživanje je sprovedeno
u periodu od januara 2013. do septembra 2014. godine. Sve osobe koje su uključene u istraživanje
pismeno su upoznate sa ciljevima i očekivanim ishodima istraživanja, procedurom uzimanja uzorka i
potpisale su pristanak za učešće. Sa svim ispitanicima postupalo se po principima dobre kliničke prakse.
Etički komitet Medicinskog fakulteta Univerziteta u Istočnom Sarajevu, Republika Srpska, dao je
saglasnost za sprovođenje ovog istraživanja.

4.2. ISPITANICI
U studiji su ispitanici podijeljeni u dvije grupe: studija I: ispitivanje antibakterijskog efekta ozona u
karijesnim kavitetima zuba i studija II: ispitivanje biokompatibilnosti ozona u odnosu na zubnu pulpu.

4.2.1. Studija I: antibakterijski efekat ozona u karijesnim kavitetima zuba.
Ispitivanjem su obuhvaćene osobe starije od 18 godina koje su se javile na Katedru za dentalnu patologiju
Medicinskog fakulteta Univerziteta u Istočnom Sarajevu, Republika Srpska, radi sanacije karijesa.
Kriterijumi za uključivanje u studiju su bili: postojanje najmanje jedne duboke karijesne lezije na okluzalnoj
ili okluzalnoj i aproksimalnoj površini bočnih zuba koja je zahvatila više od polovine debljine dentina,
procjenjeno na osnovu retroalveolarnog radiograma; odsustvo kliničkih znakova i simptoma ireverzibilnog
oštećenja pulpe, kao što su spontani bolovi ili perzistencija bola poslije djelovanja podražaja; pozitivan
test vitaliteta na hladni (Endo-Frost-50C; Coltene/Whaledent, Altstatten, Switzerland) i električni
(Analytical Technologies, Redmond, WA) nadražaj, odsustvo apscesa i otoka u parodoncijumu i
parodontalnih džepova dubine >4mm; odsustvo radioloških znakova oboljenja apeksnog i lateralnog
parodoncijuma, odustvo radioloških znakova interne i eksterne resorpcije i/ili kalcifikacija u zubnoj pulpi.
Osobe sa sistemskim oboljenjima, žene u toku trudnoće i osobe koje su uzimale antibiotsku terapiju
najmanje mjesec dana prije uzimanja uzorka nisu uključene u istraživanje. Od svakog ispitanika u
istraživanje je uključen samo jedan zub.

4.2.2. Studija II: biokompatibilnost ozona u odnosu na zubnu pulpu.
Ispitivanjem su obuhvaćene osobe starije od 18 godina koje su se javile na Katedru za oralnu rehabilitaciju
Medicinskog fakulteta Univerziteta u Istočnom Sarajevu, Republika Srpska, radi ekstrakcije donjih molara
iz ortodontskih razloga ili devitalizacije ovih zuba iz protetskih razloga. U istraživanje su uključeni intaktni
MATERIJAL I METODE
4.

21
zubi bez kliničkih znakova i simptoma ireverzibilnog oštećenja pulpe koji su reagovali na hladni (Endo-
Frost-50C; Coltene/Whaledent, Altstatten, Switzerland) i električni (Analytical Technologies, Redmond,
WA) nadražaj i kod kojih nisu zabilježeni apsces i otok u parodoncijumu i parodontalni džep dubine >4mm,
kao i radiološki znaci oboljenja apeksnog i lateralnog parodoncijuma, internih i eksternih resorpcija i/ili
kalcifikacija u zubnoj pulpi. Ispitanici koji su u anamnezi dali podatak o postojanju sistemskog oboljenja ili
koji su uzimali antibiotsku ili antiinflamatornu terapiju najmanje mjesec dana prije uzimanja uzorka pulpe
su isključeni iz istraživanja. Od svakog ispitanika u istraživanje je uključen samo jedan zub.

4.2.3. Veličina uzorka
Studija I- Veličina uzorka za ocjenu razlike u antibakterijskom efektu ozona i 2% hlorheksidina određena je
na osnovu istraživanja Müller i sar. (2007). Pri statističkoj moći testa od 80% (greška II tipa) i nivoom
značajnosti od 5% (greška I tipa) izračunata je veličina uzorka od 48 karijesnih lezija, po 24 u grupi
(G*Power 3.1, Faul i sar., 2007).
Studija II- Uzimajući u obzir da nema dostupnih podataka o uticaju ozona na nivo VEGF u zubnoj pulpi,
potreban broj uzoraka određen je na osnovu pilot istraživanja na 12 uzoraka. Na osnovu dobijenih
srednjih vrijednosti i standardnih devijacija u grupi tretiranoj ozonom i kontrolnoj grupi, najmanje 19 zuba
po grupi je bilo potrebno da bi se obezbjedila moć testa od 80% i nivo značajnosti od 5% (G*Power 3.1,
Faul i sar., 2007).

4.2.4. Randomizacija
U studiji I i II tretmani su dodijeljeni izvlačenjem terapijskog protokola iz zapečaćene koverte od osobe
koja nije bila uključena u istraživanje. Jedna osoba je sprovela sve terapijske procedure u studiji I i II u cilju
standardizacije protokola i načina uzimanja uzoraka. Uzimajući u obzir izgled i karakteristike aparata za
generisanje ozona, ispitanici su kao i osoba koja je sprovela klinički dio istraživanja bili upoznati sa vrstom
tretmana. Da bi se smanjila pristrasnost, u studiji I randomizacija je izvršena neposredno poslije uzimanja
prvog uzorka karijesnog dentina, odnosno poslije preparisanja kaviteta na okluzalnoj površini zuba u
studiji II. Svi uzorci su bili kodirani brojevima, a osobe koje su sprovele analize uzoraka nisu bile upoznate
kojoj terapijskoj grupi uzorak pripada.

4.3. KLINIČKA PROCEDURA I UZIMANJE UZORAKA
4.3.1. Studija I
Poslije primjene lokalnog anestetika (1,8ml, Scandonest 3%, Plain, Septodont, Paris, France) operativno
područje je izolovano. Sterilnim rotirajućim okruglim dijamantskim instrumentom za visokoturažnu
bušilicu uz vodeno hlađenje otvoren je kavitet i/ili uklonjena podminirana gleđ. Sterilnim rotirajućim
okruglim karbidnim instrumentom za kolenjak uklonjen je karijesno promijenjeni dentin sa gleđno-
dentinske granice i bočnih zidova kaviteta. Uklonjen je samo površinski dio karijesnog dentina. Klasifikacija
MATERIJAL I METODE
4.

22
karijesnog dentina je izvršena na osnovu vlažnosti (suv, vlažan), boje (žuta, svijetlo smeđa i tamno smeđa)
i konzistencije (tvrda-tvrdoća kao i zdrav dentin, srednje tvrda, („kožasta“ konzistencija)-može da se ukloni
ekskavatorom uz primjenu većeg pritiska, i meka konzistencija-lako može da se ukloni ekskavatorom)
(Maltz i sar., 2002; Gu i sar., 2010). Poslije ispiranja kaviteta sterilnom destilovanom vodom i posušivanja
sterilnom vaticom, prvi uzorak dentina (S1) uzet je sa bukalne polovine karijesne lezije sterilnim karbidnim
svrdlom za kolenjak veličine 3 (Kidd i sar., 1993), prethodno natopljenim u sterilni fiziološki rastvor. Da bi
se obezbijedilo uzimanje približno istih količina karijesnog dentina sa mjesta uzorokovanja, prije početka
istraživanja izvršena je kalibracija istraživača na 20 zuba sa dubokim karijesom, koji nisu uključeni u
istraživanje. Težina uzoraka karijesnog dentina kretala se od 0,9 do 1,5 mg, a dobijena je kao razlika težine
svrdla sa uzorkom i težine samog svrdla (Adventure TM, OHAUS, Corp., Pine Brook, NY, USA). Uzorak
dentina je prenesen u Ependorf posudu (2ml) u kojoj se nalazio 1ml tioglikolata i u roku od pola sata
transportovan u mikrobiološku laboratoriju radi daljih analiza. U prvoj, eksperimentalnoj grupi primjenjen
je ozon (OZ-grupa) (ElectroMagneTron®, Biozon Mylius Company, München, Germany) pomoću CA sonde
sa silikonskom kapicom na vrhu, u cilju obezbjeđivanja što intimnijeg kontakta sonde sa tretiranom
površinom. Kavitet je tretiran ozonom u trajanju od 40 sekundi i pri intenzitetu 5 (jako visoki intenzitet,
intenzitet 0-5), prema preporuci proizvođača za dezinfekciju kaviteta. Potom je uzet drugi uzorak dentina
(S2) na isti način kao prvi, samo sa oralne polovine lezije. Ovim postupkom omogućeno je da oba uzorka
dentina budu uzeta sa iste dubine kaviteta (Massara i sar., 2002). U drugoj, komparativnoj grupi, prema
uputstvu proizvođača manja količina 2% hlorheksidina (HH-grupa) (Consepsis, Ultradent, South Jordan,
Utah, USA) četkicom je primjenjena u kavitet u trajanju od 60 sekundi. Poslije posušivanja kaviteta, drugi
uzorak dentina je uzet na isti način kao u grupi tretiranoj ozonom. Po uzimanju uzoraka, karijesno
promijenjeno tkivo je u potpunosti uklonjeno, zubi su zaštićeni subpodlogom na bazi kalcijum hidroksida i
restaurisani direktnim restaurativnim ispunima. Ni jedan od primjenjenih antiseptika nije inaktivisan prije
uzimanja drugog uzorka dentina.

4.3.2. Studija II
Za lokalnu anesteziju je upotrebljen 1,8 ml 3% mepivakain (Scandonest 3%, Plain, Septodont, Paris,
France), anestetik bez adrenalina, da bi se održao nivo intrapulpne cirkulacije. Poslije primjene lokalnog
anestetika, operativno područje je izolovano i očišćeno 2% hlorheksidinom. Na okluzalnoj provršini zuba
visokoturažnom bušilicom uz vodeno hlađenje formiran je kavitet u dentinu sterilnim rotirajućim okruglim
i fisurnim dijamantskim instrumentima odgovarajuće veličine. Rotirajući instrumenti su mijenjani poslije
svake četvrte preparacije, da bi se spriječilo zagrijavanje zubne pulpe. Širina preparisanog kaviteta je bila
4mm, a dubina kaviteta 2/3 debljine dentina, određena na osnovu preoperativnog retroalveolarnog
radiograma i prenesena u kavitet pomoću endodontskog instrumenta sa graničnikom. U grupi tretiranoj
ozonom (ElectroMagneTron®, Biozon Mylius Company, München, Germany) kavitet je izložen djelovanju
gasnog ozona u trajanju od 40 sekundi pri intenzitetu 5 (jako visoki intenzitet, intenzitet 0-5), prema
preporuci proizvođača za dezinfekciju kaviteta, uz korišćenje CA sonde sa silikonskom kapicom na vrhu (u
cilju obezbjeđivanja što intimnijeg kontakta sonde sa kavitetom). U kontrolnoj grupi u kavitet je
postavljena sterilna vatica natopljena fiziološkim rastvorom. Trepanacija pulpne komore u obje grupe je
urađena sterilnim okruglim i fisurnim dijamantskim rotirajućim instrumentima za visokoturažnu bušilicu
MATERIJAL I METODE
4.

23
uz vodeno hlađenje. Poslije pažljivog uklanjanja krova komore pulpe, pristupni kavitet je ispran fiziološkim
rastvorom da se uklone ostaci dentina. Pulpa je iz komore uklonjena sterilnim pulpekstirpatorom
odgovarajuće veličine i prenijeta u Ependorf posude (2ml) kojima je prethodno određena težina. Epruvete
sa tkivom su opet izmjerene, zamrznute u tečnom azotu i čuvane na temperaturi od -80°C do daljih
analiza. Poslije uzimanja uzorka zubi su ili ekstrahovani ili je nastavljeno endodontsko liječenje prema
standardnoj proceduri. Mjerenje težine je obavljeno na Adventure TM digitalnoj vagi (OHAUS, Corp., Pine
Brook, NY, USA). Težina uzorka određena je kao razlika težine Ependorf posude sa uzorkom i prazne
Ependorf posude.

4.4. MIKROBIOLOŠKA ANALIZA UZORAKA
4.4.1. Određivanje ukupnog broja bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. metodom
kultivisanja
Uzorci karijesnog dentina su vorteksirani u trajanju od 30 sekundi i razblaženi u sterilnom fiziološkom
rastvoru. Po 0,1 ml nerazblaženog i razblaženog uzorka, razblaženja do 10-6, zasijano je na različitim
hranjivim podlogama. Za izolaciju Lactobacillus spp. korišćen je Man, Rogosa i Sharpe agar (MRS) (Difco
Laboratories, Teddington, Middlesex, UK). Za izolaciju bakterija Streptococcus spp. korišćen je Mitis
Salivarius agar (MSA) sa dodatkom sterilnog 1% kalijum telurita (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland).
Ukupan broj bakterija je određen na krvnom agaru sa dodatkom 5% ovčije krvi (Brain heart infusion agar).
Sve podloge su inkubirane u uslovima sa 10% C02 na temperaturi od 37°C u periodu od 48h (Lima i sar.,
2009). Krvni agar je inkubiran i u aerobnim uslovima na temperaturi od 37°C u periodu od 48h radi
određivanja ukupnog broja aerobnih bakterija. Prisustvo Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. na
hranjivim podlogama potvrđeno je na osnovu makroskopskog izgleda kolonija, bojenja po Gramu i
biohemijskih testova. Broj bakterijskih kolonija (engl. Colony forming units (CFU)) određen je
makroskopski, na hranjivoj podlozi sa određenim razblaženjem na kojoj se nalazilo između 20-300
bakterijskih kolonija, i izražen je po mililitru uzorka (CFU/ml).

4.4.2. Identifikacija različitih vrsta Lactobacillus spp. biohemijskim testom
Identifikacija Lactobacillus spp. do nivoa vrste urađena je pomoću biohemijskog testa API 50 CH
(bioMérieux, Inc., Lyon, France) koji se bazira na fermentaciji 49 različitih ugljenih hidrata. Postupak je
sproveden u potpunosti prema uputstvu proizvođača. Sterilnim brisom kolonije Lactobacillus spp.
različitog izgleda uzete su sa MRS podloge i rastvorene u sterilnom 0,85% rastvoru NaCl dok se nije dobila
zamućenost rastvora koja odgovara 2McFarland standardu (Densichek™. bioMérieux, Inc., Lyon, France), a
zatim je rastvor dodat API CHL medijumu. Poslije homogenizacije, bakterijski rastvor je inokulisan u 50
epruveta na API 50 CH trakama, vodeći računa da u epruvetama ne zaostanu mjehurići vazduha. Epruvete
su zatim prekrivene mineralnim uljem i inkubirane u aerobnim uslovima na temperaturi od 36°C±2°C.
Rezultati su očitani poslije 48h. Pozitivan test odgovara promjeni ljubičaste boje bromokrezola u žuto,
osim za eculin test (epruveta broj 25) gdje se boja mijenja u crno. Promjena boje je posljedica oksidacije i
stvaranja kiseline u anaerobnim uslovima koja djeluje na pH indikator koji se nalazi u epruveti. Epruveta
MATERIJAL I METODE
4.

24
pod rednim brojem 1. predstavlja negativnu kontrolu i u njoj se ne nalazi niti jedan aktivni sastojak. Nalaz
testova je zabilježen na papirnim šemama i konačan biohemijski profil je određen na osnovu
identifikacionog softvera apiwebTM (bioMérieux, Inc., Lyon, France).
Mikrobiološka analiza uzoraka kultivisanjem i biohemijska identifikacija Lactobacillus spp. do nivoa vrste
sprovedena je u Službi za medicinsku mikrobiologiju sa parazitologijom i virusologijom Univerzitetske
bolnice u Foči, Republika Srpska.

4.4.3. Određivanje ukupnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. „real-time“
lančanom reakcijom polimeraze (qPCR)
Lančana reakcija polimeraze (PCR) predstavlja in vitro reakciju umnožavanja unaprijed poznatog segmenta
DNK, primjenom dizajniranih prajmera, nukleotida i termostabilne Taq-polimeraze u prisustvu jona Mg2+.
Milionsko umnožavanje ciljne sekvence DNK ograničene prajmerima omogućena je smjenom tri procesa
koji se odvijaju na različitim temperaturama (denaturacija, 94-95°C; hibridizacija, 50-60°C i elongacija,
72°C) u određenim vremenskim intervalima, kroz niz ponovljenih ciklusa, od 35-40. Za razliku od klasične
PCR reakcije, gde se prisustvo specifične ciljne sekvence dokazuje kada je reakcija ušla u plato fazu, kod
„real-time“ lančane reakcije polimeraze (qPCR) softverski se prati prinos amplifikacije kroz cikluse, putem
detekcije fluorescentih signala koji emituju fluorescentne boje, koje se vezuju za PCR produkte.
Za procjenu zastupljenosti bakterija putem qPCR u ovom istraživanju korišćeni su odgovarajući referentni
sojevi kao standardi (serija različitih razblaženja DNK). Kvantitativna analiza ukupnog broja anaerobnih
bakterija izražena je u broju kopija gena za 16S rRNK po miligramu uzorka (genska kopija/mg). U
kompleksnoj bakterijskoj populaciji nije moguće procijeniti broj ćelija putem qPCR jer različite bakterijske
vrste posjeduju različit broj vezanih gena za rRNK (operoni, od 1 do 15) (Vianna i sar., 2006). Za izolaciju
totalne bakterijske DNK (Gram pozitivne i Gram negativne anaerobne bakterije) iz uzorka dentina korišćen
je komercijalni kit „Qiamp DNA Mini Kit“ (Qiagen, Hilden, Germany). Nakon primjenjenog protokola za
izolaciju bakterijska DNK je rastvorena u 100 μl pufera za eluciju. Prajmeri koji su korišćeni za detekciju
genoma svih anaerobnih bakterijskih vrsta hibridizuju sa visoko konzerviranom sekvencom gena za 16S
rRNK (rDNK geni), a koja odgovara poziciji 331-797bp kod Escherichia coli (tabela 1.) (Nadkarni i sar.,
2002). Amplifikacija date ciljne sekvence u okviru gena za 16S RNK prethodno je dokazana klasičnom PCR
reakcijom dok je specifičnost PCR produkta veličine 466bp. provjerena na 8% poliakrilamidnom gelu
(PAA). Primjenom komercijalnog kita "Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix" (Thermo Scientific,
Waltham, MA, USA) qPCR reakcija je praćena na „Line-Gene“ PCR aparatu (Bioer Technology Co.,Ltd,
Tokyo, Japan). Reakcionu smješu u volumenu od 20 μl za qPCR reakciju činile su sljedeće komponente: 10
μl 2X SYBR Green Master Mix, 0,25 μM prajmera-EuF, EuR (po 1 μl), 6 μl H2O i 2 μl uzorka DNK izolovane
iz dentina. Temperaturni profil reakcije prikazan je u tabeli 1. Za provjeru specifičnosti qPCR reakcije
nakon amplifikacije, reakcija je bila podvrgnuta temperaturnom opsegu od 72 do 95°C, koji dovodi do
denaturacije produkta od 466bp na određenoj temperaturi (82°C) u svim uzorcima. Svaki uzorak je
analiziran u duplikatu.
MATERIJAL I METODE
4.

25
Kao referentni soj za dobijanje standardne krive korišćena je bakterija Prevotella melaninogenica (ATCC
25845). Na osnovu baze podataka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome) veličina genoma P.
melaninogenica iznosi 3,17Mb (3,17·106 baza), a što konverzijom u težinu iznosi 3,24fg (težina jedne
kopije genoma). Konverzija je urađena na osnovu formule: DNA težina (pg) = veličina genoma (bp)·1,023
E-9 (Dolezel i sar., 2003). Za procjenu broja kopija gena za rRNK u svaku qPCR reakciju pored uzoraka koji
su analizirani bila je uključena i serija standarda (DNK P. melaninogenica) sa faktorom razblaženja od 10X.
Pošto 3,24fg DNK vrste P. melaninogenica predstavlja jednu ćeliju (jedna kopija bakterijskog genoma), a
poznato je da različite vrste Prevotella spp. imaju maksimalno 2 rDNK operona (grupe gena za rRNK),
napravljena je serija razblaženja za standard od 32,4fg DNA (20 gena za rDNA) do 32,4ng DNA (2·107 gena
za rDNA). Kvantitativni podaci su dobijeni primjenom „Line Gene K“ programa (Bioer Technology Co.,Ltd,
Tokyo, Japan). U svakom analiziranom uzorku dentina određen je broj genskih kopija poređenjem sa
brojem genskih kopija standardne krive, odnosno putem putem očitavanja korelacije između Ct vrednosti
(vrijeme kada reakcija ulazi u eksponencijalni rast) i broja genskih kopija.

Tabela 1. PCR prajmeri i temperaturni profili za identifikaciju ukupnog broja anaerobnih bakterija,
Lactobacillus spp. i vrste Lactobacillus casei/paracasei metodama qPCR i PCR
Prajmer
Sekvenca
PCR
produkt (bp)
Temperaturni
profil
EuF
EuR
5'TCCTACGGGAGCACAGT 3'
5'GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT 3'
466
94°C 10min.
40 ciklusa
94°C (1min.), 60°C (1min.), 72°C(1min.30s)
72°C (5min.)
LactoF
LactoR
5'TGGAAACAGRTGCTAATACCG3'
5'GTCCATTGTGGAAGATTCCC3'

231-233
95°C 10min.
40 ciklusa
95°C (15s.), 62°C (1min.)
72°C (5min.)
LcaseF
LcaseR
5'GCACCGAGATTCAACATGG3'
5' GGTTCTTGGATYTATGCGGTATTAG3'

117
94°C 10min.
40 ciklusa
95°C (15s.), 60°C (1min.)
72°C (5min.)

Po istom principu kao za ukupan broj anaerobnih bakterija, u karijesnom dentinu analizirana je
zastupljenost svih bakterija Lactobacillus spp.. Broj različitih vrsta roda Lactobacillus spp. izražen je u broju
ćelija, odnosno genskih kopija po miligramu uzorka (genska kopija/mg) (sve vrste imaju isti broj gena za
rRNK) (Byun i sar., 2004). Kao referentni soj za kvantitativnu analizu bakterija Lactobacillus spp. korišćena
je vrsta L. casei (ATCC 393). Prema podacima o sekvenci genoma prosječna veličina DNK svih vrsta
Lactobacillus spp. pronađenih u usnoj duplji je 2,2Mb, a primjenom odgovarajuće formule izračunata je
težina jednog genoma (1 ćelija) koji ima vrijednost 2,3fg DNK (Byun i sar., 2004). Serija standarda koja je
korišćena u qPCR reakciji za kvantifikaciju ukupnog broja Lactobacillus spp. predstavljala je seriju
razblaženja L. casei od 230fg DNK (102 ćelija) do 2,3ng DNK (106 ćelija). U svakoj PCR reakciji pored
uzoraka DNK iz dentina korišćeni su i standardi različite koncentracije sa ciljem da se odredi broj kopija
genoma koji je u direktoj korelaciji sa brojem ćelija. Prije qPCR, za dokazivanje prisustva genoma
MATERIJAL I METODE
4.

26
Lactobacillus spp. od oko 230bp korišćena je klasična PCR reakcija. Sekvence prajmera i temperaturni
profil za detekciju ukupnog broja Lactobacillus spp. dati su u tabeli 1. Reakciona smeša za qPCR reakciju je
bila identična recepturi navedenoj za kvantifikaciju ukupnog broja anaerobnih bakterija. Specifičnost
reakcije je dodatno potvrđena na osnovu krive topljenja PCR produkata od 230bp.

4.4.4. Određivanje učestalosti vrste Lactobacillus casei/paracasei lančanom reakcijom
polimeraze (PCR)
Primjenom klasičnog PCR određena je zastupljenosti vrste Lactobacillus casei/paracasei u uzorcima
karijesnog dentina. Prajmeri specifične sekvence u temperaturnim uslovima, navedenim u tabeli 1.,
dovode do sinteze PCR produkata dužine 117bp. U svakoj PCR reakciji paralelno sa testiranim uzorcima
korišćena je pozitivna (referentni soj) i negativna kontrola (voda) sa ciljem da se izbjegnu lažno negativni i
lažno pozitivni rezultati. Za reakciju amplifikacije korišćen je „PCR Master Mix“ (Thermo Scientific,
Waltham, MA, USA) i to 10 μl, po 1 μl LcaseF i LcaseR prajmera, 6 μl H2O i 2 μl uzorka DNK izolovane iz
dentina. Putem elektroforeze na 8% PAA gelu provjereno je prisustvo specifičnog amplifikata od 117bp.
Vizuelizacija PCR produkata izvršena je putem bojenja sa etidijum bromidom.
Mikrobiološka analiza uzoraka metodama qPCR i PCR je sprovedena na Institutu za humanu genetiku,
Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu, Republika Srbija.

4.5. KVANTIFIKACIJA VEGF I SOD U ZUBNOJ PULPI
4.5.1. Priprema uzoraka
Nakon odmrzavanja, u Ependorf posude sa uzorkom unijeta je određena količina pufera za lizu tkiva
(20ml/1g tkiva; CellLytic MT, Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland) i uzorak je mašinski homogenizovan na
temperaturi od 4°C. Lizat je zatim centrifugiran na 12000-20000xg u trajanju od 10 minuta u
mikrocentrifugi Heraeus* Biofuge Primo R (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Izdvojeni
supernatant za svaki uzorak je zatim podijeljen u dvije Ependorf posude, alikot za analizu nivoa VEGF i
alikot za analizu nivoa SOD. Supernatanti su čuvani na -20°C do daljih analiza.

4.5.2. Određivanje nivoa VEGF u zubnoj pulpi imunoesejskom tehnikom
Kvantitativno određivanje nivoa VEGF u pulpi sprovedeno je sendvič ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) imunoesejskom tehnikom uz korišćenje komercijalnog kompleta „Human VEGF
ELISA Kit“ (Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland) za ćelijski i tkivni lizat. Postupak je sproveden u potpunosti
prema uputstvu proizvođača. U svaku od 96 reakcionih komora na mikrotitracionoj pločici ubačeno je po
100 μl standarda ili uzorka. Poslije inkubacije od 2 sata i 30 minuta na sobnoj temperaturi i ispiranja
reakcionih komora uliveno je po 100 μl pripemljenog biotin antitijela i pločica je ponovo inkubirana na
sobnoj temperaturi uz lagano miješanje u trajanju od jednog sata. Poslije ispiranja reakcionih komora
dodato je u svaku od njih 100 μl pripremljenog rastvora streptavidina i ponovljena je inkubacija u trajanju
MATERIJAL I METODE
4.

27
od 45 minuta na sobnoj temperaturi uz lagano miješanje. Zatim je ponovljen postupak ispiranja i dodat je
rastvor peroksidaznog supstrata 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (100 μl). Poslije inkubacije od 30 minuta na
sobnoj temperaturi uz lagano miješanje bez prisustva svjetlosti, dodato je u svaku od komora 50 μl
rastvora 0,2 M sumporne kiseline za prekidanje enzimske reakcije, pri čemu se boja reakcionih rastvora
mijenjala iz različitih inteziteta plave boje u žutu boju različitih inteziteta. Odmah zatim je izvršeno
očitavanje optičkih gustina rastvora na aparatu Multiskan EX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA). Korišćenjem programa Sigma Plot 12 (SyStat Software Inc, IL, USA) određena je formula standardne
krive na osnovu optičkih gustina faktora rasta poznatih koncentracija. Za svaki uzorak i standard su
sprovedena mjerenja u duplikatu i krajnja koncentracija uzorka i standarda je izračunata kao njihova
srednja vrijednost. Nivo VEGF prikazan je po jedinici zapremine (pg/ml).

4.5.3. Određivanje nivoa SOD u zubnoj pulpi spektrofotometrijskom metodom
Aktivnost SOD je određena spektrofotometrijskom metodom pomoću „SOD Assay Kit-WST“ (Sigma
Aldrich, Buchs, Switzerland). Postupak je sproveden u potpunosti prema uputstvu proizvođača. U
unaprijed određene reakcione komore na mikrotitracionoj pločici aplikovano je po 20 μl uzorka (komore
označene kao „sample“ i „blank 2“) i 20 μl dvostruko destilovane vode (komore „blank 1“ i „blank 3“).
Zatim je u svaku od komora dodato 200 μl rastvora tetrazolijumske soli (2-(4-lodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-
(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolijum, mononatrijumska so). U sljedećem koraku po 20 μl pufera je dodato u
komore označene kao „blank 2“ i „blank 3“ i po 20 μl enzimskog rastvora u komore označene kao
„sample“ i „blank 1“. Pločica je inkubirana na temperaturi od 37°C u trajanju od 20 minuta. SOD aktivnost
je određena kao procenat inhibicije stvaranja boje WAST-1 formazana (2-(4-lodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-
(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolijum, mononatrijumska so) na aparatu Multiskan EX (Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, USA) pri absorbansi od 440nm. Aktivnost SOD (% inhibicije) je izračunata matematički
prema sljedećoj formuli:
SOD aktivnost (%)={[(Ablank1-Ablank3)-(Asample1-Ablank2)]/(Ablank1-Ablank3)}x100
Analize uzoraka pulpe su sprovedene u Istraživačkoj laboratoriji Klinike za bolesti zuba Stomatološkog
fakulteta Univerziteta u Beogradu, Republika Srbija.

4.6. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA
Statistička obrada podataka je urađena u SPSS programu 19.0 (IBM SPSS Statistics for Windows, Version
19.0. Armonk, NY: IBM Corp, USA). Rezultati su prikazani kao srednje vrijednosti i standardne devijacije
(SD) za numerička i učestalosti za atributivna obilježja. Izvršeno je testiranje normalnosti raspodjele u
studiji I (Kolmogorov-Smirnovljev test) i dobijeno je da godine imaju normalnu raspodjelu (Kolmogorov-
Smirnovljev test, p>0,05) dok broj bakterija nije pratio normalnu raspodjelu (Kolmogorov-Smirnovljev test,
p<0,05). Razlike u karakteristikama ispitanika i uzorka između grupa određene su t-testom za dva
nezavisna uzorka (godine) i hi-kvadrat testom (pol, kliničke karakteristike uzorka). Za ispitivanje
antibakterijskog efekta antiseptika primijenjeni su MekNemarov test za atributivna i Vilkoksonov test
MATERIJAL I METODE
4.

28
ekvivalentnih parova za numerička obilježja. Za komparativnu analizu antibakterijskog efekta ozona i
hlorheksidina primjenjeni su hi-kvadrat test za atributivna i Man-Vitnijev test za numerička obilježja.
Poveznost kliničkih karakteristika lezije i broja bakterija određena je primjenom Spirmanovog koeficijenta
korelacije. U studiji II podaci su pratili normalnu raspodjelu (Kolmogorov-Smirnovljev test, p>0,05), te su
za ispitivanje razlika između grupa primjenjeni t-test za dva nezavisna uzorka za numerička (godine, nivo
VEGF i SOD) i hi-kvadrat test za atributivna obilježja (pol). Vrijednosti p<0,05 su smatrane statistički
značajnim u svim analizama.

29
R E Z U L T A T I

5.

30

S T U D I J A    I
-antibakterijski efekat ozona u karijesnim kavitetima zuba-
REZULTATI
5.

31
5. REZULTATI ISTRAŽIVANJA
5.1. KARAKTERISTIKE ISPITANIKA I KARIJESNOG UZORKA

Dijagram 1. predstavlja tok odabira ispitanika i formiranje istraživačkih grupa. Od 72 pregledane osobe, 24
njih je isključeno iz daljeg istraživanja jer nisu ispunile kriterijume za uključivanje u studiju (n=18), jer su
odbile da učestvuju (n=4) ili su isključene zbog drugih razloga (n=2). U istraživanje je uključeno ukupno 48
osoba koje su metodom slučajnog uzorka podijeljene u dvije grupe, eksperimentalnu, gdje je kao
antiseptik korišćen ozon (OZ-grupa) i komparativnu, gdje je kao antiseptik korišćen hlorheksidin (HH-
grupa). Kod svih ispitanika eksperimentalni protokol je sproveden u jednoj posjeti i svi uzorci karijesnog
dentina su analizirani. Prilikom izvođenja terapijskog postupka nisu zabilježeni neželjeni efekti.
U tabeli 2. prikazane su demografske karakteristike ispitanika i kliničke karakteristike uzorka u grupi
tretiranoj ozonom i grupi tretiranoj hlorheksidinom. Grupu gdje je za dezinfekciju kaviteta korišćen ozon
sačinjavalo je po 12 žena i muškaraca, starosti od 20-48 godina, a grupu gdje je korišćen hlorheksidin
sačinjavalo je 10 žena i 14 muškaraca starosti od 19-40 godina. Između ove dvije terapijske grupe nije
zabilježena značajna razlika u pogledu pola i starosne strukture (p>0,05). Uzorak su sačinjavali 14
premolara i 10 molara u grupi gdje je korišćen ozon, odnosno 15 premolara i 9 molara u grupi gdje je
primjenjen hlorheksidin. Karijesna lezija je bila lokalizovana kod oko 58,3% zuba na okluzalnoj, odnosno
kod oko 41,7% zuba na okluzalnoj i aproksimalnoj površini zuba u grupi gdje je korišćen ozon, dok je u
grupi gdje je primjenjen hlorheksidin kod 66,7% zuba lezija lokalizovana samo na okluzalnoj, a kod 33,3%
zuba je zahvatila i aproksimalnu površinu zuba. Nije uočena značajna razlika u zastupljenosti zuba u
odnosu na morfološku grupu i lokalizaciji karijesa između dvije grupe (p>0,05).

REZULTATI
5.

32

Dijagram 1. Odabir ispitanika i formiranje istraživačkih grupa

Pregledano
(n=72)
Isključeno (n=24)
- Nisu zadovoljavali kriterijume za
uključivanje (n= 18)
− Odbili da učestvuju (n=4)
− Drugi razlozi (n=2)
Analizirani
(n= 24)

Odabrani za tretman ozonom
(n=24)

Analizirani
(n= 24)

Odabrani za tretman hlorheksidinom
(n=24)

Raspodjela ispitanika
Analiza
Randomizacija
(n=48)
Odabir ispitanika
REZULTATI
5.

33

Tabela 2. Demografske karakteristike ispitanika i kliničke karakteristike uzorka u grupi tretiranoj ozonom
(OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa)
Karakteristike
ispitanika/uzorka
Veličina uzorka
(ukupno 48)

OZ-grupa
(ukupno 24)

HH-grupa
(ukupno 24)

P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%
Demografske

   Godine starosti
   (srednja vrijednost ± SD)
28,40 ± 7,24

29,75 ± 8,07

27,04 ± 6,18
0,198

   Pol

Žene
22
45,8

12
50,0

10
41,7
0,772

Muškarci
26
54,2

12
50,0

14
58,3

Kliničke

   Morfološka grupa zuba

Gornji premolari
22
45,8

11
45,8

11
45,8
0,829

Gornji molari
13
27,1

6
25,0

7
29,2

Donji premolari
7
14,6

3
12,5

4
16,7

Donji molari
6
12,5

4
16,7

2
8,3

   Površina zuba sa karijesom

Okluzalna
26
54,2

10
41,7

16
66,7
0,147

Okluzalna i
aproksimalna
22
45,8

14
58,3

8
33,3

* t-test za dva nezavisna uzorka za godine starosti; Hi-kvadrat test za ostale varijable

REZULTATI
5.

34
U tabeli 3. su prikazane karakteristike karijesnog dentina u eksperimentalnoj i komparativnoj grupi. U
grupi tretiranoj ozonom kod najvećeg broja kaviteta karijesne mase su okarakterisane kao vlažne (66,7%),
srednje-tvrde (kožaste) konzistencije (50%) i svijetlo smeđe boje (41,7%). U grupi gdje je primjenjen
hlorheksidin u najvećem broju slučajeva karijes je ocijenjen kao vlažan (62,5%), meke konzistencije
(45,8%), a boja karijesa je varirala od žute (33,3%), svijetlo smeđe (37,5%) do tamno smeđe nijanse
(29,2%). Nije zabilježena značajna razlika u pogledu ispitivanih kliničkih karakteristika karijesnog dentina
između grupa (p>0,05).

Tabela 3. Karakteristike karijesnog dentina u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj
hlorheksidinom (HH-grupa)
Karakteristike karijesnog
dentina
Veličina uzorka
(ukupno 48)

OZ-grupa
(ukupno 24)

HH-grupa
(ukupno 24)

P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%
   Vlažnost karijesa

Suv
17
35,4

8
33,3

9
37,5
1,000

Vlažan
31
64,6

16
66,7

15
62,5

   Konzistencija karijesa

Tvrda
10
20,8

4
16,7

6
25,0
0,335

Srednje tvrda
19
39,6

12
50,0

7
29,2

Meka
19
39,6

8
33,3

11
45,8

   Boja karijesa

Žuta
14
29,2

6
25,0

8
33,3
0,817

Svijetlo smeđa
19
39,6

10
41,7

9
37,5

Tamno smeđa
15
31,3

8
33,3

7
29,2

* Hi-kvadrat test

REZULTATI
5.

35
5.2. ANTIBAKTERIJSKI EFEKAT OZONA

5.2.1. Efekti ozona i hlorheksidina na ukupan broj bakterija ispitivani metodom
kultivisanja

5.2.1.1. Broj kaviteta sa aerobnim bakterijama
Prije primjene oba antiseptika, kako ozona tako i hlorheksidina, iz svih kaviteta izolovane su aerobne
bakterije. Aerobne bakterije su izolovane i iz svih kaviteta poslije primjene ozona, dok poslije primjene
hlorheksidina aerobne bakterije nisu izolovane iz 12,5% kaviteta. Smanjenje broja kaviteta iz kojih su
izolovane aerobne bakterije nije bilo statistički značajno ni u jednoj od grupa (p>0,05) (tabela 4.).
Tabela 4. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo aerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2)
primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-
grupa)

Prisustvo aerobnih bakterija

Tretman
Ukupan broj
uzoraka
S1

S2
P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%
OZ-grupa
24
24
100,0

24
100,0
1,000
HH-grupa
24
24
100,0

21
87,5
0,250
Ukupno
48
48
100,0

45
93,8
0,250
* MekNemarov test

5.2.1.2. Prosječan broj aerobnih bakterija
Prosječan broj aerobnih bakterija izolovanih iz karijesnog dentina prije i poslije dezinfekcije kaviteta
prikazan je u tabeli 5. U kavitetima koji su tretirani ozonom prosječan broj aerobnih bakterija je iznosio
oko 1,0·105 CFU/ml prije primjene ozona, dok je poslije primjene taj broj smanjen na 2,1·104 CFU/ml
(p<0,0001). Poslije primjene hlorheksidina prosječan broj aerobnih bakterija je značajno smanjen sa
9,2·104 CFU/ml na 2,1·104 CFU/ml (p<0,0001).
REZULTATI
5.

36
Tabela 5. Prosječan broj aerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj
ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa)
Tretman
Ukupan broj aerobnih bakterija (CFU/ml)
(X̅±SD)

S1

S2
P*
OZ-grupa
1,0·105 ± 1,3·105

2,1·104 ± 2,5·104
<0,0001
HH-grupa
9,2·104 ± 1,2·105

2,1·104 ± 4,3·104
<0,0001
Ukupno
9,7·104 ± 1,2·105

2,1·104 ± 3,4·104
<0,0001
* Vilkoksonov test ekvivalentnih parova

5.2.1.3. Broj kaviteta sa anaerobnim bakterijama
U svim netretiranim uzorcima karijesnog dentina izolovane su anaerobne bakterije. Ozon je doveo do
eliminacije anaerobnih bakterija iz 4,2% kaviteta dok hlorheksidin iz 16,7% kaviteta. Ni jedan od
primjenjenih antiseptika nije doveo do značajnog smanjenja broja kaviteta sa anaerobnim bakterijama
(p>0,05) (tabela 6.).

Tabela 6. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo anaerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2)
primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-
grupa)

Prisustvo anaerobnih bakterija

Tretman
Ukupan broj
uzoraka
S1

S2
P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%
OZ-grupa
24
24
100,0

23
95,8
1,000
HH-grupa
24
24
100,0

20
83,3
0,125
Ukupno
48
48
100,0

43
89,6
0,063
* MekNemarov test
REZULTATI
5.

37
5.2.1.4. Prosječan broj anaerobnih bakterija
U tabeli 7. je prikazan ukupan broj anaerobnih bakterija koje su izolovane iz karijesnih kaviteta prije i
poslije dezinfekcije kaviteta. U uzorcima dentina prije primjene ozona prosječan broj anaerobnih bakterija
je iznosio oko 1,1·105 CFU/ml dok je poslije primjene taj broj značajno smanjen na 2,7·104 CFU/ml
(p<0,0001). U komparativnoj grupi, prosječan broj anaerobnih bakterija je poslije primjene hlorheksidina
smanjen sa 1,2·105 CFU/ml na 2,4·104 CFU/ml (p<0,0001).

Tabela 7. Prosječan broj anaerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj
ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa)
Tretman
Ukupan broj anaerobnih bakterija (CFU/ml)
(X̅±SD)

S1

S2
P*
OZ-grupa
1,1·105 ± 1,5·105

2,7·104 ± 4,0·104
<0,0001
HH-grupa
1,2·105 ± 1,6·105

2,4·104 ± 4,1·104
<0,0001
Ukupno
1,2·105 ± 1,5·105

2,6·104 ± 4,0·104
<0,0001
* Vilkoksonov test ekvivalentnih parova

5.2.2. Efekti ozona i hlorheksidina na Lactobacillus spp. ispitivani metodom
kultivisanja i biohemijskom analizom

5.2.2.1. Broj kaviteta sa Lactobacillus spp.
U grupi gdje je korišćen ozon Lactobacillus spp. su izolovane iz 75,0% kaviteta prije i iz 66,7% kaviteta
poslije primjene lijeka. U grupi gdje je primjenjen hlorheksidin, u inicijalnim uzorcima karijesa izolovane su
Lactobacillus spp. iz 45,8% kaviteta, a poslije tretiranja kaviteta antiseptikom taj broj je smanjen na 25%.
Ni u jednoj od ispitivanih grupa antiseptik nije doveo do značajnog smanjenja broja kaviteta sa
Lactobacillus spp. (p>0,05), ali značajno smanjenje je zabilježeno na nivou cijelog uzorka (p=0,016) (tabela
8.).

REZULTATI
5.

38
Tabela 8. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2)
primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-
grupa)

Prisustvo Lactobacillus spp.

Tretman
Ukupan broj
uzoraka
S1

S2
P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%
OZ-grupa
24
18
75,0

16
66,7
0,500
HH-grupa
24
11
45,8

6
25,0
0,063
Ukupno
48
29
60,4

22
45,8
0,016
* MekNemarov test

5.2.2.2. Prosječan broj Lactobacillus spp.
U tabeli 9. prikazan je prosječan broj bakterija Lactobacillus spp. u karijesnom dentinu prije i poslije
primjene antiseptika u eksperimentalnoj i komparativnoj grupi. Prosječan broj bakterija je značajno snižen
sa 2,0·104 CFU/ml na 3,2·103 CFU/ml poslije primjene ozona (p<0,0001). Tretiranje karijesnog kaviteta
hlorheksidinom dovelo je do značajnog smanjenja prosječnog broja Lactobacillus spp. sa početnih 2,7·104
CFU/ml na 4,9·103 CFU/ml poslije primjene antiseptika (p=0,003).

Tabela 9. Prosječan broj Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj
ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa)
Tretman
Ukupan broj Lactobacillus spp. (CFU/ml)
(X̅±SD)

S1

S2
P*
OZ-grupa
2,0·104 ± 7,8·104

3,2·103 ± 1,0·104
<0,0001
HH-grupa
2,7·104 ± 9,2·104

4,9·103 ± 2,0·104
0,003
Ukupno
2,4·104 ± 8,4·104

4,1·103 ± 1,6·104
<0,0001
* Vilkoksonov test ekvivalentnih parova
REZULTATI
5.

39
5.2.2.3. Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp.
Pomoću biohemijskog testa API 50 CH prije primjene ozona iz 18 kaviteta izolovano je 14 različitih vrsta
Lactobacillus spp., najčešće između jedne i dvije različite vrste po uzorku (83,3%). Najčešće su izolovani
Lactobacillus brevis 1 (38,9%), Lactobacillus plantarum 1 (27,8%) Lactobacillus fermentum 1 (22,2%),
Lactobacillus rhamnosus (16,7%), Lactobacillus acidophilus 1 (11,1%), Lactobacillus acidophilus 2 (11,1%) i
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii (11,1%), dok je učestalost ostalih vrsta bila manja od 10%. Poslije
primjene ozona Lactobacillus spp. su izolovane iz 14 kaviteta. Izolovane su sve vrste Lactobacillus spp. koje
su izolovane i prije primjene antiseptika, ali u nešto manjem procentu, osim Lactobacillus brevis 3,
Lactobacillus fermentum 2 i Lactobacillus plantarum 2 koje nisu nađene (p>0,05) (tabela 10.).

U grupi gdje je korišćen hlorheksidin iz 11 karijesnih kaviteta, iz kojih su izolovane Lactobacillus spp., API
50 CH biohemijskim testom izolovano je 8 različitih vrsta. U najvećem broju kaviteta nalazile su se između
jedne i dvije vrste (72,7%), a najviše tri. Najčešće izolovane vrste su bile Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei 1 (54,5%), Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 3 (36,4%), L. rhamnosus (36,4%) i L. brevis 1
(18,2%). Izlaganje karijesnog kaviteta djelovanju hlorheksidina dovelo je do smanjenja broja kaviteta sa
Lactobacillus spp. i učestalost pojedinih vrsta, dok vrste L. plantarum 1, Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei 2 i Lactobacillus salivarius koje su nađene u inicijalnim uzorcima nisu izolovane (p>0,05) (tabela
11.).

REZULTATI
5.

40
Tabela 10. Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene ozona (OZ-grupa)

Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp.
(ukupan broj pozitivnih uzoraka 18)

S1

S2

P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%

Lactobacillus acidophilus 1
2
11,1

1
5,6

1,000
Lactobacillus acidophilus 2
2
11,1

1
5,6

1,000
Lactobacillus acidophilus 3
1
5,6

1
5,6

1,000
Lactobacillus brevis 1
7
38,9

5
27,8

0,500
Lactobacillus brevis 2
1
5,6

1
5,6

1,000
Lactobacillus brevis 3
1
5,6

0
0,0

1,000
Lactobacillus fermentum 1
4
22,2

2
11,1

0,500
Lactobacillus fermentum 2
1
5,6

0
0,0

1,000
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii
2
11,1

1
5,6

1,000
Lactobacillus pentosus
1
5,6

1
5,6

1,000
Lactobacillus plantarum 1
5
27,8

5
27,8

1,000
Lactobacillus plantarum 2
1
5,6

0
0,0

1,000
Lactobacillus rhamnosus
3
16,7

3
16,7

1,000
Lactobacillus salivarius
1
5,6

1
5,6

1,000
* MekNemarov test

REZULTATI
5.

41
Tabela 11. Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene hlorheksidina
(HH-grupa)

Učestalost pojedinih vrsta Lactobacillus spp.
(ukupan broj pozitivnih uzoraka 11)

S1

S2

P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%

Lactobacillus acidophilus 1
1
9,1

1
9,1

1,000
Lactobacillus brevis 1
2
18,2

1
9,1

1,000
Lactobacillus plantarum 1
1
9,1

0
0,0

1,000
Lactobacillus rhamnosus
4
36,4

2
18,2

0,500
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 1
6
54,5

4
36,4

0,500
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 2
1
9,1

0
0,0

1,000
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 3
4
36,4

3
27,3

1,000
Lactobacillus salivarius
1
9,1

0
0,0

1,000
* MekNemarov test

U cjelokupnom uzorku na početku istraživanja iz 29 kaviteta izolovano je 17 različitih vrsta Lactobacillus
spp., u najvećem broju između jedne i dvije vrste po uzorku (79,3%). Najčešće su izolovane L. brevis 1
(31,0%), L. rhamnosus (24,1%), L. paracasei ssp. paracasei 1 (20,7%), L. plantarum 1 (20,7%) i L.
fermentum 1 (13,8%), L. paracasei ssp. paracasei 3 (13,8%) i L. acidophilus 1 (10,3%). Poslije tretiranja
kaviteta antiseptikom, zabilježeno je smanjenje broja kaviteta iz kojih su izolovane Lactobacillus spp.
(45,8%) i učestalost pojedinih vrsta, dok vrste L. brevis 3, L. fermentum 2, L. plantarum 2, L. paracasei ssp.
paracasei 2, izolovane prije dezinfekcije, nisu nađene.

REZULTATI
5.

42
5.2.3. Efekti ozona i hlorheksidina na Streptococcus spp. ispitivani metodom
kultivisanja

5.2.3.1. Broj kaviteta sa Streptococcus spp.
U svim uzorcima karijesnog dentina u grupi gdje je korišćen ozon izolovane su Streptococcus spp. prije
tretiranja kaviteta antiseptikom. Poslije primjene ozona došlo je do eliminacije ove bakterijske vrste u
samo jednom uzorku (p>0,05). U komparativnoj grupi, Streptococcus spp. su izolovane iz 95,8% kaviteta
prije i iz 50% kaviteta poslije primjene hlorheksidina. Ovo smanjenje broja kaviteta u grupi tretiranoj
hlorheksidinom je bilo statistički značajno (p=0,001) (tabela 12.).

Tabela 12. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo Streptococcus spp. prije (S1) i poslije (S2)
primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-
grupa)

Prisustvo Streptococcus spp.

Tretman
Ukupan broj
uzoraka
S1

S2
P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%
OZ-grupa
24
24
100,0

23
95,8
1,000
HH-grupa
24
23
95,8

12
50,0
0,001
Ukupno
48
47
97,9

35
72,9
<0,001
* MekNemarov test

5.2.3.2. Prosječan broj Streptococcus spp.
Prosječan broj Streptococcus spp. je značajno snižen sa 5,8·104 CFU/ml prije primjene ozona na 1,3·104
CFU/ml poslije primjene (p<0,0001). Značajno smanjenje prosječnog broja Streptococcus spp. sa početnih
5,8·104 CFU/ml na 1,2·104 CFU/ml zabilježeno je poslije tretiranja karijesnog kaviteta hlorheksidinom
(p<0,0001) (tabela 13.).

REZULTATI
5.

43
Tabela 13. Prosječan broj Streptococcus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj
ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa)
Tretman
Ukupan broj Streptococcus spp. (CFU/ml)
(X̅±SD)

S1

S2
P*
OZ-grupa
5,8·104 ± 7,5·104

1,3·104 ± 2,1·104
<0,0001
HH-grupa
5,8·104 ± 9,4·104

1,2·104 ±3,1·104
<0,0001
Ukupno
5,8·104 ± 8,4·104

1,3·104 ± 2,6·104
<0,0001
* Vilkoksonov test ekvivalentnih parova

5.2.4. Korelacija kliničkih karakteristika lezije i prosječnog broja bakterija u
cjelokupnom uzorku
U tabeli 14. prikazana je povezanost kliničkih karakteristika karijesnih lezija (vlažnost, konzistencija i boja
karijesnog tkiva) i prosječnog broja Lactobacillus spp. i Streptococcus spp.. Vlažnost, konzistencija i boja
karijesnog dentina su međusobno značajno povezani (svi p<0,0001). Vlažan karijesni dentin je povezan sa
svjetlijom bojom tkiva i mekšom konzistencijom, a karijes koji je okarakterisan kao suv tamnije je boje i
tvrđe je konzistencije. Veća kolonizacija karijesnih kaviteta Lactobacillus spp. zabilježena je kod lezija sa
vlažnim karijesnim masama (p=0,033), a veći broj Streptococcus spp. je zabilježen kod lezija tamnije boje
(p=0,034).

REZULTATI
5.

44
Tabela 14. Povezanost kliničkih karakteristika lezije i prosječnog broja Lactobacillus spp. i Streptococcus
spp. u cjelokupnom uzorku

vrijednost koeficijenta*

P
Vlažnost : konzistencija
0,748

<0,0001
Vlažnost : boja
0,825

<0,0001
Konzistencija : boja
0,864

<0,0001
Vlažnost : Streptococcus spp.
-0,239

0,102
Vlažnost : Lactobacillus spp.
0,246

0,093
Konzistencija : Streptococcus spp.
-0,261

0,074
Konzistencija : Lactobacillus spp.
0,305

0,033
Boja : Streptococcus spp.
-0,307

0,034
Boja : Lactobacillus spp.
0,243

0,097
Streptococcus spp. : Lactobacillus spp.
0,168

0,255
* Spirmanov koeficijent korelacije

5.2.5. Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina
ispitivanog metodom kultivisanja

5.2.5.1. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije,
Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika
Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. i
Streptococcus spp. prije primjene antiseptika između terapijskih grupa prikazano je na grafikonu 1. Broj
kaviteta iz kojih su izolovane aerobne i anaerobne bakterije je bio isti u obje grupe, dok je broj kaviteta
pozitivnih na Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. bio nešto veći u eksperimentalnoj u odnosu na
komparativnu grupu, ali ta razlika nije bila značajna (p>0,05).

REZULTATI
5.

45
Grafikon 1. Poređenje broja kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo aerobnih bakterija, anaerobnih
bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika (S1) između grupe tretirane
ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)

Hi-kvadrat test

5.2.5.2. Poređenje prosječnog broja aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp.
i Streptococcus spp. prije primjene antiseptika
U grupi tretiranoj ozonom prosječan broj aerobnih bakterija je bio veći, a broj anaerobnih bakterija i
Lactobacillus spp. manji u odnosu na komparativnu grupu, ali ta razlika nije bila značajna (p>0,05). U obje
grupe na početku terapije broj Streptococcus spp. je bio približno isti (grafikon 2.).

0%
20%
40%
60%
80%
100%
Aerobne bakterije Anaerobne bakterije
Lactobacillus spp.
Streptococcus spp.
Broj uzoraka (%)
OZ-grupa
HH-grupa
Lactobacillus spp.        Streptococcus spp.
REZULTATI
5.

46
Grafikon 2. Poređenje prosječnog broja (±SD) aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i
Streptococcus spp. prije primjene antiseptika (S1) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe
tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)
Man-Vitnijev test

5.2.5.3. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na različite vrste Lactobacillus spp. prije primjene
antiseptika

Grafikon 3. prikazuje odnos pojedinih vrsta Lactobacillus spp. u karijesnim lezijama na početku liječenja
između grupe tretirane ozonom i grupe tretirane hlorheksidinom. L. acidophilus 1, L. brevis 1, L.
plantarum 1, L. rhamnosus i L. salivarius su izolovani u obje grupe, dok su ostale vrste izolovane ili u grupi
tretiranoj ozonom ili u grupi tretiranoj hlorheksidinom. Značajna razlika je zabilježena u učestalosti L.
paracasei ssp. paracasei 1 (p=0,001) i L. paracasei ssp. paracasei 3 (p=0,014), koji su izolovani samo u
grupi tretiranoj hlorheksidinom.

0.0E+00
5.0E+04
1.0E+05
1.5E+05
2.0E+05
2.5E+05
3.0E+05
Aerobne bakterije
Anaerobne bakterije
Lactobacillus spp.
Streptococcus spp.
Prosječan broj bakterija (CFU/ml)
OZ-grupa
HH-grupa
Lactobacillus spp.       Streptococcus spp.
REZULTATI
5.

47
Grafikon 3. Poređenje učestalosti pojedinih vrsta Lactobacillus spp. prije primjene antiseptika (S1) između
grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)

Hi-kvadrat test; *p=0,014 i **p=0,001

5.2.5.4. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na aerobne bakterije, anaerobne bakterije,
Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika
Poređenje broja kaviteta iz kojih su izolovane aerobne bakterije, anaerobne bakterije, Lactobacillus spp. i
Streptococcus spp. između grupa poslije dezinfekcije prikazano je na grafikonu 4. U grupi tretiranoj
ozonom broj kaviteta iz kojih su izolovane aerobne i anaerobne bakterije, Lactobacillus spp. i
Streptococcus spp. je bio veći u odnosu na komparativnu grupu, pri čemu je značajna razlika zabilježena za
broj kaviteta pozitivnih na Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. (oba p=0,041).

0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Broj uzoraka (%)
OZ-grupa
HH-grupa
**
*
REZULTATI
5.

48
Grafikon 4. Poređenje broja kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo aerobnih bakterija, anaerobnih
bakterija, Lactobacillus spp. i Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika (S2) između grupe tretirane
ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)

Hi-kvadrat test; *p=0,008 i **p=0,001

5.2.5.5. Poređenje prosječnog broja aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp.
i Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika
Prosječan broj aerobnih i anaerobnih bakterija u uzorcima karijesnog dentina poslije dezinfekcije kaviteta
je bio približno isti u obje grupe, eksperimentalnoj i komparativnoj. U grupi u kojoj je korišćen ozon
prosječan broj Lactobacillus spp. je bio značajno manji (p=0,041), a prosječan broj Streptococcus spp.
značajno veći (p=0,041) u odnosu na grupu gdje je primijenjen hlorheksidin (grafikon 5.).

5.2.5.6. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na različite vrste Lactobacillus spp. poslije primjene
antiseptika
Poslije primjene antiseptika nije zabilježena značajna razlika u učestalosti različitih vrsta Lactobacillus spp.
između grupe tretirane ozonom i grupe tretirane hlorheksidinom, osim za učestalost L. paracasei ssp.
paracasei 1 (p=0,014), koji je izolovan u grupi tretiranoj hlorheksidinom (grafikon 6.).

0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Aerobne bakterije Anaerobne bakterije
Lactobacillus spp.
Streptococcus spp.
Broj uzoraka (%)
OZ-grupa
HH-grupa
*
**
Lactobacillus spp.     Streptococcus spp.
REZULTATI
5.

49
Grafikon 5. Poređenje prosječnog broja (±SD) aerobnih bakterija, anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i
Streptococcus spp. poslije primjene antiseptika (S2) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe
tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)
Man-Vitnijev test; * p=0,041

Grafikon 6. Poređenje učestalosti pojedinih vrsta Lactobacillus spp. poslije primjene antiseptika (S2)
između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)

Hi-kvadrat test; *p=0,014
0.0E+00
1.0E+04
2.0E+04
3.0E+04
4.0E+04
5.0E+04
6.0E+04
7.0E+04
8.0E+04
Aerobne bakterije
Anaerobne bakterije
Lactobacillus spp.
Streptococcus spp.
Prosječan broj bakterija (CFU/ml)
OZ-grupa
HH-grupa
*
*
Lactobacillus spp.
Streptococcus spp.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Broj uzoraka (%)
OZ-grupa
HH-grupa
*
REZULTATI
5.

50
5.2.6. Efekti ozona i hlorheksidina na ukupan broj bakterija ispitivani metodom
qPCR

5.2.6.1. Broj kaviteta sa anaerobnim bakterijama
Broj kaviteta iz kojih su izolovane anaerobne bakterije prije i poslije dezinfekcije kaviteta ozonom i
hlorheksidinom, primjenom metode qPCR, prikazan je u tabeli 15. U obje grupe, u svim uzorcima dentina
na početku terapije izolovane su anaerobne bakterije kao i poslije primjene antiseptika.

Tabela 15. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo anaerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2)
primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-
grupa)

Prisustvo anaerobnih bakterija

Tretman
Ukupan broj
uzoraka
S1

S2
P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%
OZ-grupa
24
24
100,0

24
100,0
1,000
HH-grupa
24
24
100,0

24
100,0
1,000
Ukupno
48
48
100,0

48
100,0
1,000
* MekNemarov test

5.2.6.2. Prosječan broj anaerobnih bakterija
U kavitetima u kojima je primjenjen ozon prosječan broj anaerobnih bakterija je iznosio oko 7,5·105
genskih kopija/mg prije primjene ozona, dok je poslije tretiranja kaviteta taj broj smanjen na 2,4·105
genskih kopija/mg (p=0,001). Prije dezinfekcije kaviteta hlorheksidinom prosječan broj anaerobnih
bakterija je iznosio oko 8,7·105 genskih kopija/mg. Poslije primjene hlorheksidina broj anaerobnih
bakterija je smanjen na 5,7·105 genskih kopija/mg (p=0,001) (tabela 16.).

REZULTATI
5.

51
Tabela 16. Prosječan broj anaerobnih bakterija prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi
tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa)
Tretman
Ukupan broj anaerobnih bakterija (broj genskih kopija/mg)
(X̅±SD)

S1

S2
P*
OZ-grupa
7,5·105 ± 1,2·106

2,4·105 ± 2,1·105
0,001
HH-grupa
8,7·105 ± 1,2·106

5,7·105 ± 1,6·106
0,001
Ukupno
8,1·105 ± 1,2·106

4,1·105 ± 1,1·106
<0,0001
* Vilkoksonov test ekvivalentnih parova

5.2.7. Efekti ozona i hlorheksidina na ukupan broj Lactobacillus spp. ispitivani
metodom qPCR

5.2.7.1. Broj kaviteta sa Lactobacillus spp.
Lactobacillus spp. je izolovan u svim uzorcima karijesnog dentina i prije i poslije primjene antiseptika u
grupi gdje je korišćen ozon kao i u grupi gdje je primjenjen hlorheksidin (tabela 17.).

Tabela 17. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2)
primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-
grupa)

Prisustvo Lactobacillus spp.

Tretman
Ukupan broj
uzoraka
S1

S2
P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%
OZ-grupa
24
24
100,0

24
100,0
1,000
HH-grupa
24
24
100,0

24
100,0
1,000
Ukupno
48
48
100,0

48
100,0
1,000
* MekNemarov test
REZULTATI
5.

52
5.2.7.2. Prosječan broj Lactobacillus spp.
Prosječan broj bakterija je značajno snižen sa početnih 5,0·104 genskih kopija/mg na 3,5·104 genskih
kopija/mg poslije tretiranja kaviteta ozonom (p<0,0001). Izlaganje karijesnog kaviteta djelovanju
hlorheksidina dovelo je do značajnog smanjenja prosječnog broja Lactobacillus spp. sa početnih 5,0·104
genskih kopija/mg na 1,7·104 genskih kopija/mg (p<0,0001)(tabela 18.).

Tabela 18. Prosječan broj Lactobacillus spp. prije (S1) i poslije (S2) primjene antiseptika u grupi tretiranoj
ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-grupa)
Tretman
Ukupan broj Lactobacillus spp. (broj genskih kopija/mg)
(X̅±SD)

S1

S2
P*
OZ-grupa
5,0·104 ± 1,4·105

3,5·104 ± 1,0·105
<0,0001
HH-grupa
5,0·104 ± 1,5·105

1,7·104 ± 5,1·104
<0,0001
Ukupno
5,0·104 ± 1,5·105

2,6·104 ± 8,2·104
<0,0001
* Vilkoksonov test ekvivalentnih parova

5.2.8. Efekti ozona i hlorheksidina na prisustvo vrste L. casei/paracasei
ispitivani metodom PCR

5.2.8.1. Broj kaviteta sa L. casei/paracasei
Učestalost vrste L. casei/paracasei, izolovane metodom PCR, u karijesnim uzorcima prije i poslije
dezinfekcije kaviteta u grupi tretiranoj ozonom i grupi tretiranoj hlorheksidinom prikazana je u tabeli 19. U
grupi gdje je korišćen ozon, ova vrsta je izolovana iz polovine kaviteta i prije i poslije primjene lijeka
(p>0,05). U kavitetima gdje je korišćen hlorheksidin, L. casei/paracasei je izolovana iz 33,3% uzoraka prije
primjene, odnosno iz 29,2% uzoraka poslije primjene komparatora (p>0,05).

REZULTATI
5.

53
Tabela 19. Broj kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo L. casei/paracasei prije (S1) i poslije (S2)
primjene antiseptika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i grupi tretiranoj hlorheksidinom (HH-
grupa)

Prisustvo L. casei/paracasei

Tretman
Ukupan broj
uzoraka
S1

S2
P*
broj
uzoraka
%

broj
uzoraka
%
OZ-grupa
24
12
50,0

12
50,0
1,000
HH-grupa
24
8
33,3

7
29,2
1,000
Ukupno
48
20
41,7

19
39,6
1,000
* MekNemarov test

5.2.9. Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina
ispitivanog metodom qPCR

5.2.9.1. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. prije
primjene antiseptika
Iz svih kaviteta prije primjene antiseptika izolovane su anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. i u grupi
tretiranoj ozonom i u grupi tretiranoj hlorheksidinom (p>0,05) (grafikon 7.).

5.2.9.2. Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. prije primjene
antiseptika
Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. prije dezinfekcije kaviteta između
eksperimentalne i komparativne grupe prikazano je na grafikonu 8. Broj anaerobnih bakterija je bio nešto
veći u komparativnoj grupi, dok je broj Lactobacillus spp. bio približno isti u obje ispitivane grupe, grupe
tretirane ozonom i grupe tretirane hlorheksidinom (p>0,05).

REZULTATI
5.

54
Grafikon 7. Poređenje broja kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo anaerobnih bakterija i Lactobacillus
spp. prije primjene antiseptika (S1) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane
hlorheksidinom (HH-grupa)

Hi-kvadrat test

Grafikon 8. Poređenje prosječnog broja (±SD) anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. prije primjene
antiseptika (S1) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)

Man-Vitnijev test
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Anaerobne bakterije
Lactobacillus spp.
Broj uzroaka (%)
OZ-grupa
HH-grupa
Lactobacillus spp.
0.0E+00
5.0E+05
1.0E+06
1.5E+06
2.0E+06
2.5E+06
Ukupan broj bakterija
Lactobacillus spp.
Prosječan broj genskih kopija/mg
OZ-grupa
HH-grupa
Lactobacillus spp.
REZULTATI
5.

55
5.2.9.3. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. poslije
primjene antiseptika
Poslije primjene antiseptika anaerobne bakterije i Lactobacillus spp. su izolovane iz svih kaviteta i u
eksperimentalnoj i u komparativnoj grupi (p>0,05) (grafikon 9.).

Grafikon 9. Poređenje broja kaviteta u kojima je zabilježeno prisustvo anaerobnih bakterija i Lactobacillus
spp. poslije primjene antiseptika (S2) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane
hlorheksidinom (HH-grupa)

Hi-kvadrat test

5.2.9.4. Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. poslije primjene
antiseptika
Poređenje prosječnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. poslije primjene antiseptika između
eksperimentalne i komparativne grupe prikazano je na grafikonu 10. Poslije primjene antiseptika u
komparativnoj grupi je zabilježen veći broj anaerobnih bakterija i manji broj Lactobacillus spp. u
poređenju sa grupom gdje je korišćen ozon, ali ta razlika nije bila statistički značajna (p>0,05).

0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Anaerobne bakterije
Lactobacillus spp.
Broj uzroaka (%)
OZ-grupa
HH-grupa
Lactobacillus spp.
REZULTATI
5.

56
Grafikon 10. Poređenje prosječnog broja (±SD) anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. poslije primjene
antiseptika (S2) između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-grupa)
Man-Vitnijev test

5.2.10. Komparativna analiza antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina na
vrstu L. casei/paracasei ispitivanog metodom PCR

 5.2.10.1. Poređenje broja kaviteta pozitivnih na L. casei/paracasei prije i poslije primjene
antiseptika
Poređenje učestalosti vrste L. casei/paracasei u karijesnim kavitetima prije i poslije primjene antiseptika
između grupe tretirane ozonom i grupe tretirane hlorheksidinom prikazano je na grafikonu 11. Učestalost
L. casei/paracasei je bila veća u karijesnim uzorcima u grupi gdje je korišćen ozon, i prije i poslije primjene
lijeka, ali ta razlika nije bila statistički značajna (p>0,05).

0.0E+00
5.0E+05
1.0E+06
1.5E+06
2.0E+06
2.5E+06
Ukupan broj bakterija
Lactobacillus spp.
Prosječan broj genskih kopija/mg
OZ-grupa
HH-grupa
Lactobacillus spp.
REZULTATI
5.

57
Grafikon 11. Poređenje broja kaviteta u kojima je izolovan L. casei/paracasei prije (S1) i poslije (S2)
primjene antiseptika između grupe tretirane ozonom (OZ-grupa) i grupe tretirane hlorheksidinom (HH-
grupa)

Hi-kvadrat test

0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Broj uzoraka (%)
L. casei/paracasei (S1)                            L. casei/paracasei (S2)
OZ-grupa
HH-grupa
L.casei/paracasei (S1)
L. casei/paracasei (S2)
REZULTATI
5.

58

S T U D I J A    II
-biokompatibilnost ozona u odnosu na zubnu pulpu-
REZULTATI
5.

59
5.3. KARAKTERISTIKE ISPITANIKA I UZORKA

Dijagram 2. predstavlja tok odabira ispitanika i formiranje istraživačkih grupa. Pregledano je 55 osoba i
njih 38, koje su ispunile kliničke i radiografske kriterijume, su uključene u istraživanje. Metodom slučajnog
izbora ispitanici su podijeljeni u dvije grupe, eksperimentalnu, gdje je korišćen ozon (OZ-grupa) i
kontrolnu. Kod svih ispitanika eksperimentalni protokol je sproveden u jednoj posjeti i svi uzorci pulpe su
analizirani. Prilikom izvođenja terapijskog postupka nisu zabilježeni neželjeni efekti.

Dijagram 2. Odabir ispitanika i formiranje istraživačkih grupa

Pregledano
(n=55)

- Nisu zadovoljavali kriterijume za
uključivanje (n=17)

Analizirani
(n= 19)

Odabrani za tretman ozonom
(n=19)

Analizirani
(n= 19)

Odabrani za kontrolu grupu
(n=19)

Raspodjela ispitanika
Analiza
Randomizacija
(n=38)
Odabir ispitanika
REZULTATI
5.

60
U tabeli 20. prikazane su karakteristike ispitanika uključenih u istraživanje u eksperimentalnoj i kontrolnoj
grupi. U ispitivanoj populaciji veća je bila zastupljenost osoba ženskog pola: 73,7% u grupi tretiranoj
ozonom i 84,2% u kontrolnoj grupi. Ispitanici u grupi gdje je korišćen ozon su imali između 20 i 40 godina
(prosječna starost 26,9 godina), dok su ispitanici u kontrolnoj grupi imali između 18 i 40 godina (prosječna
starost 25 godina). Nije zabilježena značajna razlika u pogledu pola i starosne struktrure između grupa
(p>0,05).

Tabela 20. Demografske karakteristike ispitanika u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i kontrolnoj grupi

Veličina uzorka
(ukupno 38)

OZ-grupa
(ukupno 19)

Kontrolna grupa
(ukupno 19)

Karakteristike ispitanika

P*
broj
osoba
%

broj
osoba
%

broj
osoba
%
Godine starosti
(srednja vrijednost ± SD)
25,97 ± 6,07

26,95 ± 6,53

25,00 ± 5,59
0,330

Pol

Žene
30
78,9

14
73,7

16
84,2
0,693

Muškarci
8
21,1

5
26,3

3
15,8

 * t-test za dva nezavisna uzorka za godine starosti; Hi-kvadrat test za pol

5.4. EFEKAT OZONA NA NIVO VEGF U ZUBNOJ PULPI

Koncentracije VEGF u grupi tretiranoj ozonom i kontrolnoj grupi su prikazane u tabeli 21. Koncentracije
VEGF u zdravoj pulpi zuba čiji su kaviteti izloženi djelovanju gasnog ozona su značajno veće, za oko 24% u
odnosu na vrijednosti dobijene za pulpe kontrolnih zuba (p<0,0001).

REZULTATI
5.

61
Tabela 21. Koncentracije VEGF u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i kontrolnoj grupi

VEGF (pg/ml)
P*
Tretman
Ukupan broj
uzorka
X̅±SD

Rang

Min.

Max.
OZ-grupa
19
1023,39 ± 176,59

738,00

1304,00
<0,0001
Kontrolna grupa
19
776,18 ± 207,13

511,00

1185,00
Ukupno
38
899,79 ± 90,36

511,00

1304,00
* t-test za dva nezavisna uzorka

5.5. EFEKAT OZONA NA NIVO SOD U ZUBNOJ PULPI

Tabela 22. prikazuje aktivnost SOD u eksperimentalnoj i kontrolnoj grupi. U pulpama zdravih zuba čiji su
kaviteti tretirani ozonom aktivnost SOD je bila značajno manja, za oko 6%, u odnosu na kontrolne pulpe
(p=0,002).
Tabela 22. Aktivnost SOD u grupi tretiranoj ozonom (OZ-grupa) i kontrolnoj grupi

SOD (% inhibicije)
P*
Tretman
Ukupan broj
uzorka
X̅±SD

Rang

Min.

Max.
OZ-grupa
19
88,69 ± 3,76

80,30

94,10
0,002
Kontrolna grupa
19
92,04 ± 2,39

87,08

95,23
Ukupno
38
90,36 ± 3,54

80,30

95,23
* t-test za dva nezavisna uzorka

62
D I S K U S I J A

6.
DISKUSIJA
6.

63
6. DISKUSIJA

U studiji I ispitivan je antiseptički efekat ozona na bakterije u dubokom karijesu poslije djelimičnog
uklanjanja karijesnog tkiva. Primjenom kultivisanja ili molekularnih metoda (PCR ili qPCR) određen je
ukupan broj bakterija i bakterija Streptococcus spp. i Lactobacillus spp., kao i pojedinih vrsta Lactobacillus
spp. prije i poslije primjene antiseptika. Antibakterijski efekat ozona poređen je sa 2% hlorheksidinom
(komparator) jednim od najčešće korišćenih antiseptika za dezinfekciju kaviteta prije primjene
restaurativnih materijala (Lafuente, 2012).
U ovom istraživanju je ispitivano ukupno 48 karijesnih lezija od 48 ispitanika. Broj uzoraka je određen prije
početka istraživanja, na osnovu nalaza in vitro studije o antibakterijskoj efikasnosti gasnog ozona i 2%
hlorheksidina, kultivisanjem bakterija (Müller i sar., 2007). Rezultati ove in vitro studije moguće da nisu
najpodesniji za kontrolu veličine uzorka za ispitivanje efikasnosti antiseptika u kliničkim uslovima, posebno
kada se u istraživanju primjenjuje qPCR metod. Međutim, razlog za uzimanje ove studije je taj što su u
periodu dizajniranja istraživanja to bili jedini dostupni podaci. Za sada antibakterijska efikasnost ozona i
hlorheksidina u in vivo uslovima komparativno je ispitivana samo u jednom istraživanju Hauser-Gerspach i
sar. (2009), ali je korišćen 1% hlorheksidin. Uključivanjem samo jednog zuba kod jednog pacijenta,
ograničen je statistički efekat grupisanja podataka (Schwendicke i sar., 2013a).
Pristrasnost prilikom biranja i randomizacije uzorka je veoma važan faktor u kliničkim istraživanjima kako
bi se obezbjedila objektivnost i validnost rezultata (Schwendicke i sar., 2013a). U ovom istraživanju klinički
postupak uzimanja uzoraka sproveo je jedan istraživač, u cilju obezbjeđivanje standardizovane procedure.
Ispitanici i istraživač su bili upoznati kojoj terapijskoj grupi ispitanik pripada, jer zbog fizičko-hemijskih
karakteristika primjenjenih antiseptika nije bilo moguće obezbjediti „slijep“ dizajn. Da bi se umanjila
pristrasnost prilikom uzimanja uzoraka, pripadnost grupi je određena tek poslije uzimanja prvog uzorka
karijesnog dentina izvlačenjem terapijskog protokola iz zapečaćene koverte. Uzorci su kodirani brojevima i
njihova mikrobiološka analiza je vršena simultano, odnosno u istom aktu analizirani su uzorci dentina prije
i poslije primjene antiseptika. Analize uzoraka kultivisanjem i molekularnim metodama (PCR i qPCR) su
uradila dva istraživača, koja nisu učestvovala u kliničkom dijelu ispitivanja.
Uzorak karijesnog dentina uzet je prema metodologiji preporučenoj od strane Kidd i sar. (1993). Broj
bakterija određen kultivisanjem nije izražen u jedinici mase (CFU/mg) već u jedinici volumena (CFU/ml),
kao i u drugim sličnim istraživanjima (Toi i sar., 2003; Bönecker i sar., 2003; Orhan i sar., 2008; Duque i
sar., 2009; Rolland i sar., 2011). Uzimajući u obzir da je ovom metodom omogućeno uzimanje sličnih
količina karijesnog dentina različitih konzistencija sa mjesta uzorkovanja (Bjørndal i sar., 1997, Paddick i
sar., 2005) i da je izvršena kalibracija istraživača na ekstrahovanim zubima prije početka istraživanja, može
se pretpostaviti da nije postojala značajna razlika u količini uzorkovanog dentina između grupa.
Dobijeni rezultati pokazuju da ne postoji značajna razlika u demografskim karakteristikama ispitanika (pol,
starosna dob) i kliničkih karakteristika uzorka (morfološka grupa zuba, površina zuba sa karijesom,
vlažnost, konzistencija i boja karijesnog dentina) između ispitivanih grupa. Eksperimentalna i
DISKUSIJA
6.

64
komparativna grupa nisu se razlikovale u broju aerobnih i anaerobnih bakterija, Lactobacillus spp. i
Streptococcus spp. određenih kultivisanjem, kao ni u ukupnom broju anaerobnih bakterija i Lactobacillus
spp. određenih metodom qPCR i učestalosti L. casei/paracasei određene PCR na početku istraživanja.
Jedina značajna razlika je zabilježena u učestalosti vrsta Lactobacillus spp. i to L. paracasei ssp. paracasei 1
i L. paracasei ssp. paracasei 3 jer su izolovane samo u grupi tretiranoj hlorheksidinom kultivisanjem.
Stoga, može se pretpostaviti da su sve promjene u broju bakterija zabilježene poslije primjene antiseptika
posljedica njihovog direktnog djelovanja.
Identifikacija i određivanje ukupnog broja bakterija (aerobnih i anaerobnih), Streptococcus spp.,
Lactobacillus spp., kao i pojedinih vrsta Lactobacillus spp. izvršena je kultivisanjem. Kultivisanje je metod
koji se najčešće koristi za određivanje broja i vrste bakterija u karijesnim kavitetima, kao i za ispitivanje
efikasnosti različitih antibakterijskih protokola u terapiji karijesa (Frencken i sar., 2007; Orhan i sar., 2008;
Duque i sar., 2009; Rolland i sar., 2011; Maltz i sar., 2012a). Ovaj metod se karakteriše zasijavanjem
inokuluma odmah po uzimanju uzorka na odgovarajućim hranjivim podlogama u precizno definisanim
laboratorijskim uslovima. U našem istraživanju, prosječan broj aerobnih i anaerobnih bakterija,
Lactobacillus spp. i Streptococcus spp., određen kultivisanjem poslije djelimičnog uklanjanja karijesa, a
prije primjene antiseptika je u okvirima onih koji su zabilježeni u drugim sličnim istraživanjima (Bjørndal i
Larsen, 2000; Bönecker i sar., 2003; Orhan i sar., 2008).
Bakterijski sastav lezije predstavlja odraz lokalnih uslova sredine, uključujući i karakteristike same lezije.
Sve lezije su prije primjene antiseptika klasifikovane na osnovu boje, vlažnosti i konzistencije tkiva kako bi
se ispitao mogući uticaj ovih kliničkih karakteristika na bakterijski sastav. Rezultati korelacione analize su
pokazali da sva tri ispitivana klinička parametra lezije međusobno značajno koreliraju. Kako se
konzistencija tkiva mijenja od mekših ka tvrđim, tako se mijenja i vlažnost, od vlažnijih ka suvim karijesnim
masama, i boja, od svjetlijih ka tamnijim nijansama. Ovi rezultati su u skladu sa nalazima koji ukazuju na
povezanost boje i konzistencije dentina kao i na poveznost vlažnosti i konzistencije (Orhan i sar., 2008;
Corralo i Maltz, 2013). Rezultati istraživanja o povezanosti kliničkih karakteristika lezija i broja bakterija
pokazuju da je ukupan broj bakterija, kao i broj S. mutans i Lactobacillus spp. je značajno veći u lezijama sa
mekšim i vlažnijim karijesnim masama (Ayna i sar., 2003; Orhan i sar., 2008). U našem istraživanju broj
Lactobacillus spp. je značajno veći u karijesnim lezijama mekše konzistencije, što ukazuje na veću
bakterijsku aktivnost u razmekšanom u poređenju sa čvršćim dentinom. Postoje analize koje pokazuju da
boja karijesnog dentina nije povezana sa stepenom bakterijske infekcije tako da boja nije adekvatan
parametar za dijagnostikovanje oboljenja i određivanje aktivnosti lezije (Orhan i sar., 2008; Lula i sar.,
2011; Corralo i Maltz, 2013). Ipak, veoma čest nalaz u karijesnim kavitetima jesu karijesne lezije tamnije
boje i mekše konzistencije, što ukazuje na određenu aktivnost lezije. U prilog tome govori i nalaz o
značajnoj povezanosti Streptococcus spp. sa lezijama tamnije boje u našem istraživanju.
Poslije primjene ozona u trajanju od 40 sekundi na karijesni dentin, kultivisanjem bakterija zabilježeno je
značajno smanjenje ukupnog broja bakterija za 75,4%, za aerobne, odnosno za 79% za anaerobne
bakterije u poređenju sa vrijednostima prije primjene antiseptika. Slično smanjenje ukupnog broja
bakterija je zabilježeno i poslije primjene 2% hlorheksidina u trajanju od 60 sekundi (77,2% za aerobne i
80% za anaerobne bakterije). Razlika između eksperimentalne i komparativne grupe nije bila statistički
DISKUSIJA
6.

65
značajna. Pored efekta na ukupan broj bakterija, oba terapijska protokola su dovela i do značajnog
smanjenja ukupnog broja Lactobacillus spp. i Streptococcus spp., kao i smanjenje učestalosti, iako ne
značajnog, pojedinih vrsta Lactobacillus spp.. Poređenjem antibakterijskog efekta između grupa uočeno je
da je broj Lactobacillus spp. bio značajno manji, a broj Streptococcus spp. značajno veći poslije primjene
ozona u poređenju sa hlorheksidinom. Takođe, broj kaviteta iz kojih su izolovane pomenute bakterijske
vrste je bio značajno veći poslije primjene ozona u poređenju sa hlorheksidinom. Posmatrano u odnosu na
vrstu, značajna razlika je zabilježena u učestalosti L. paracasei ssp. paracasei 1, koja je izolovana u većem
broju iz kaviteta u komparativnoj grupi, ali treba imati u vidu da je značajna razlika u učestalosti ove vrste
između grupa zabilježena i prije primjene antiseptika. Iako nisu doveli do potpune eliminacije bakterija,
značajno smanjenje broja bakterija u karijesnom tkivu poslije primjene ozona i hlorheksidina u ovom
istraživanju ukazuje na značaj primjene antiseptika u indirektnoj terapiji dobokog karijesa.
Pored velikog broja in vitro i in situ istraživanja (Nagayoshi i sar., 2004; Polydorou i sar., 2006; Müller i sar.,
2007; Castillo i sar., 2008; Johansson i sar., 2009; Polydorou i sar., 2012; Kollmuss i sar., 2014), samo u
nekoliko studija ispitivan je efekat ozona na kariogene bakterije u kliničkim uslovima primjenom metode
kultivisanja. U dvije studije zabilježeno je značajno smanjenje broja bakterija poslije djelovanja ozona, ali
bez poređenja rezultata sa kontrolnom grupom. Baysan i Lynch (2007) su, ispitujući uticaj ozona na
mirkroorganizme u primarnim karijesnim lezijama korijena i njegov efekat na progresiju oboljenja, našli da
primjena ozona u trajanju od 10 ili 20 sekundi značajno smanjuje ukupan broj mikroorganizama. Takođe,
na kontrolnim pregledima 3 i 5,5 mjeseci poslije primjene ozona autori su našli da je kod 50,8% od
analiziranih lezija došlo do očvršćavanja dentina, kod 41,5% do smanjenja indeksa oštećenja sa vrijednosti
2 na vrijednost 1, a kod 7,7% lezija nisu zabilježili nikakve promjene poslije primjene ozona u trajanju od
10 ili 20 sekundi. Klinička studija Dukić i sar. (2013) ukazuje da primjena ozona u trajanju od 40 sekundi na
karijesni dentin u dubokim karijesnim lezijama na stalnim molarima dovodi do značajnog smanjenja
ukupnog broja bakterija, kao i S. mutans i Lactobacillus spp..
Nalazi o antibakterijskoj efikasnosti hlorheksidina na karijesni dentin u kliničkim uslovima su različiti. Ersin
i sar. (2006) su ispitivali uticaj atraumatske restaurativne terapije, kao i antibakterijski uticaj hlorheksidina
kao dezinficijensa u karijesnim kavitetima, i to istog oblika koji je korišćen u našem istraživanju. Autori su
uočili da je 6 mjeseci od završene restaurativne terapije, primjena hlorheksidina dovela do značajnog
smanjenja broja bakterija u poređenju sa kontrolnom grupom, u kojoj nije korišćen antiseptik za
dezinfekciju. Frencken i sar. (2007) su ispitivali efekat dodavanja hlorheksidina glas jonomer cementu u
cilju poboljšavanja njegovog antibakterijskog djelovanja u karijesnim kavitetima. Autori su zabilježili da 7
dana poslije primjene, kombinacija ova dva materijala značajno smanjuje ukupan broj bakterija u
karijesnom i od karijesa očišćenom dentinu i da je to smanjenje značajno veće u poređenju sa kontrolnom
grupom (konvencionalni glas jonomer cement). Sa druge strane, Wicht i sar. (2004) nisu zabilježili
značajan antibakterijski efekat laka koji predstavlja kombinaciju 1% hlorheksidina i 1% timola na ukupan
broj bakterija 6 nedjelja poslije primjene na karijesno tkivo za razliku od kombinacije demeklociklina
(antibiotika) i triamcinolona (kortikosteroida) u obliku paste.
Samo u jednoj kliničkoj studiji poređen je efekat gasnog ozona u odnosu na 1% hlorheksidin, kao pozitivnu
kontrolnu grupu, na bakterije koje se nalaze u karijesnim kavitetima mliječnih molara (Hauser-Gerspach i
DISKUSIJA
6.

66
sar., 2009). Rezultati pomenutog istraživanja pokazuju da primjena gasnog ozona u trajanju od 30 sekundi
i 1% hlorheksidina u istom trajanju ne dovodi do značajnog smanjenja broja bakterija u otvorenim
karijesnim lezijama mliječnih molara. Značajno smanjenje nije zabilježeno ni poslije djelimičnog uklanjanja
karijesa ni u jednoj od ispitivanih grupa, što je u suprotnosti sa rezultatima našeg istraživanja. Razlika u
odnosu na naše istraživanje se može pripisati velikom broju bakterija u karijesnom dentinu prije
uklanjanja karijesa i primjene antiseptika (log 7,9-odgovara približno 100 miliona ćelija) i u uzorcima
dentina poslije djelimičnog uklanjanja karijesa i primjene antiseptika (log 7,5) u pomenutoj studiji. Naime,
smanjenje broja bakterija je izražajnije ukoliko je početni broj bakterija manji u odnosu na one karijesne
lezije koje karakteriše prisustvo većeg broja bakterija (Thanomsub i sar., 2002), kao što je u istraživanju
Hauser-Gerspach i sar. (2009). U obzir treba uzeti i da se bakterijski sastav karijesnih lezija mliječnih zuba
značajno razlikuje i manje je raznolik od sastava bakterija koje se nalaze u karijesnim lezijama stalnih zuba
(Aas i sar., 2008). Naime, efikasnost antibakterijskih supstanci zavisna je od vrste bakterija na koje djeluju.
Važan faktor koji determiniše antibakterijsko djelovanje je i doza primjenjenog antiseptika. U pomenutom
istraživanju korišćen je zatvoreni sistem generatora ozona (HealOzone, KaVo, Biberach, Germany) koji
proizvodi ozon u tačno određenoj koncentraciji, od 2100 ppm i protoku od 613 cm3/min. Sa druge strane
generator ozona primjenjen u našem istraživanju pripada otvorenom sistemu generatora. Prema uputstvu
proizvođača generator stvara 2,9 mg/s ozona (AV sonda intnezitet 5), odnosno na mjestu primjene od 1
do 300 000 ppm ozona zavisno od izabranog programa, što predstavlja ograničenje ovog načina primjene
antiseptika. Prednost u odnosu na zatvoreni sistem se ogleda u tome što preko posebnih nastavaka-sondi,
ozon može biti primijenjen i na manje dostupna mjesta (parodontalni džep i kanal korijena). Pored razlike
u koncentracijama ozona, koncentracija primjenjenog 2% hlorheksidina kao komparatora u našem
istraživanju je veća od koncentracije primjenjene u studiji Hauser-Gerspach i sar. (2009), gdje je korišćen
1% hlorheksidin.
Identifikacija i kvantifikacija ukupnog broja anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. i vrste L.
casei/paracasei izvršena je i primjenom molekularnih metoda: qPCR ili PCR. Analiza broja bakterija qPCR
pokazuje da se poslije primjene ozona od 40 sekundi značajno smanjuje broj anaerobnih bakterija (68%) i
Lactobacillus spp. (30%) od početnih vrijednosti, dok je učestalost L. casei/paracasei, određena PCR,
ostala skoro nepromijenjena. Hlorheksidin (2%) primjenjen u trajanju od 60 sekundi je doveo do
značajnog smanjenja broj anaerobnih bakterija, za 34,5%, i broja Lactobacillus spp., za 66%, od vrijednosti
koje su zabilježene prije primjene antiseptika. Vrsta L. casei/paracasei je poslije primjene hlorheksidina
izolovana iz sedam od osam kaviteta koji su bili pozitivni na ovu vrstu prije primjene antiseptika.
Komparativna analiza nije pokazala postojanje značajne razlike u antibakterijskoj efikasnosti između ozona
i hlorheksidina. Značajno smanjenje broja bakterija poslije primjene antiseptika određeno qPCR metodom,
pored već zabilježenog smanjenja broja bakterija kultivisanjem, pokazuje na značaj primjene ozona i
hlorheksidina u indirektnoj terapiji dubokog karijesa. Uzimajući u obzir da su molekularne metode
korišćene za ispitivanje efikasnosti restaurativnih protokola u veoma malom broju studija (Gu i sar., 2010),
kao i da u tim studijama nije ispitivana efikasnost ozona i/ili hlorheksidina, nije moguće izvršiti
komparativnu analizu dobijenih rezultata.
PCR predstavlja molekularni metod koji omogućava kvalitativnu identifikaciju određenog mikroorganizma
primjenom prajmera za specifičan gen. Nedostatak ove metode, u nemogućnosti kvantifikacije broja
DISKUSIJA
6.

67
mikroorganizama, prevaziđen je qPCR. qPCR predstavlja enzimsku reakciju u kojoj se dva sintetska
oligonukleotidna prajmera i fluoroscentna proba hibridizuju sa nukleotidnom baznom sekvencom koja je
karakteristična za ciljani organizam u uzorku. Praćenjem oslobađanja fluoroscence sa svakim PCR
ciklusom, progresija reakcije i količina DNK mogu da se prate u funkciji vremena, čime je omogućeno
određivanje ukupnog broja mikroorganizama, bakterija ili pojedinih bakterijskih vrsta. U našem
istraživanju ukupan broj anaerobnih bakterija i Lactobacillus spp. određen metodom qPCR kao i
učestalosti L. casei/paracasei  određena PCR su značajno veće u poređenju sa vrijednostima dobijenim
kultivisanjem, što je u skladu sa nalazima i drugih studija gdje je komparirana osjetljivost ove dvije metode
identifikacije i kvantifikacije bakterija (Nadkarni i sar., 2002; Martin i sar., 2002; Byun i sar., 2004). Veći
broj kopija gena u odnosu na broj kolonija određen kultivisanjem, posljedica je veće osjetljivosti qPCR,
kojom može da se detektuje između 10 i 108 ćelija (Heid i sar., 1996). Osim teoretski veće osjetljivosti
qPCR, veći broj bakterija određen ovom molekularnom metodom je posljedica i nekih ograničenja
kultivisanja. U slučajevima kada se bakterije nalaze u agregatima, kao što je slučaj sa dentalnim plakom i
karijesom, disperzija bakterija u pojedinačne ćelije prije zasijavanja na hranjive podloge može biti
nepotpuna poslije miješanja uzorka. Sa druge strane, pretjerano miješanje koje se koristi u toku
kultivisanja može dovesti do smrti ćelije. Takođe, mogu se kultivisati samo žive ćelije, ukoliko se
bakterijama obezbjede metaboličke i fiziološke potrebe koje imitiraju uslove in vivo. Uzmajući u obzir
kompleksnost oralne flore i specifične nutritivne potrebe pojedinih bakterija nekada je ove uslove teško
obezbjediti u eksperimentalnim uslovima. Smatra se da oko 50% oralne flore još uvijek nije moguće
kultivisati (Nadkarni i sar., 2002). Treba uzeti u obzir i da jedna kolonija na hranjivoj podlozi ne predstavlja
uvijek jednu bakterijsku ćeliju, što je još jedan od razloga manjeg broja bakterija određenih kultivisanjem.
Jedan od glavnih nedostataka qPCR metode je što određuje DNK ne samo živih već i mrtvih i liziranih ćelija
u uzorku. Tako, stres i oštećenja bakterija uzrokovani djelovanjem antiseptika kao i promjene u njihovoj
metaboličkoj aktivnosti (Fogel i sar., 1999) mogu uticati na veći broja bakterija određenih qPCR metodom
u poređenju sa kultivisanjem. Primjena „reverse-transcriptase“ qPCR (RT-qPCR), kojom se određuje broj
samo metabolički aktivnih bakterija, mogla bi dati realniju sliku o odnosu kultivisanja i molekularnih
metoda u određivanju broja bakterija u karijesnim uzorcima, kao i efikasnosti pojedinih terapijskih
protokola.
Imajući u vidu da je qPCR osjetljivija metoda za kvantifikaciju bakterija u odnosu na kultivisanje bakterija
sa jedne strane, i sa druge strane naše nalaze da se antibakterijski efekat ozona i hlorheksidina ne razlikuje
metodom qPCR, zapažene razlike između antibakterijskog efekta ozona i hlorheksidina prema
Lactobacillus spp. odnosno Streptococcus spp. dobijene kultivisanjem su najvjerovatnije posljedica manje
osjetljivosti metode kultivisanja, a ne razlike u antibakterijskom efektu ozona i hlorheksidina.

DISKUSIJA
6.

68
U studiji II ispitivana je biokompatibilnosti ozona u odnosu na tkivo pulpe određivanjem nivoa VEGF i SOD
poslije njegove primjene na otvorene dentinske kanaliće u trajanju od 40 sekundi.
Istraživanjem su obuhvaćeni klinički zdravi i intaktni zubi, bez znakova patoloških promjena u pulpnom
tkivu ili apeksnom i lateralnom parodoncijumu. Između ispitanika eksperimentalne i kontrolne grupe nije
zabilježena značajna razlika u pogledu pola i starosne strukture, uzimajući u obzir da pojedini autori nalaze
da starenje ima uticaj na nivo VEGF i SOD u zubnoj pulpi (Davis i sar., 1991; Matsuzaka i sar., 2008). Na
svakom zubu ispreparisani su duboki kaviteti (2/3 debljine dentina) da bi se imitirali uslovi koji odgovaraju
upotrebi ozona kao odontoantiseptika u terapiji dubokog karijesa. Preparacija kaviteta je sprovedena uz
obilno hlađenje i rotirajući instrumenti su mijenjani poslije svake četvrte preparacije da se spriječi uticaj
toplote na tkivo pulpe (Costa i sar., 2011). Naime, postoje nalazi koji ukazuju da preparacija kaviteta može
dovesti do inflamatorne reakcije u pulpi i povećanja nivoa SOD (Baumgardner i sar., 1999; Varavara i sar.,
2012).
Klinički postupak uzimanja uzoraka sproveo je jedan istraživač, u cilju obezbjeđivanja standardizovane
procedure. Ispitanici i istraživač su bili upoznati kojoj terapijskoj grupi ispitanik pripada zbog fizičko-
hemijskih karakteristika generatora ozona. Da bi se umanjila pristrasnost prilikom uzimanja uzoraka,
pripadnost grupi je određena tek poslije završene preparacije kaviteta, izvlačenjem terapijskog protokola
iz zapečaćene koverte. Uzorci su kodirani brojevima i analiza je spovedena od strane osobe koja nije
učestvovala u kliničkom dijelu istraživanja.
VEGF je faktor rasta čije prisustvo utiče na vitalnost i funkcionalnosti ćelija (Paranjpe i sar., 2007). Iako
postoje istraživanja o nivou VEGF u zdravoj pulpi, ovakvih podataka nema za pulpu izloženu djelovanju
ozona. Rezultati ove studije, dobijene ELISA imunoesejom, su pokazali da je koncentracija VEGF u zdravoj
pulpi bila 776,2 pg/ml. Ovi nalazi su u skladu sa rezultatima Tran-Hung i sar. (2008) koji su supernatantima
dobijenim iz kulture intaktnih ćelija humane pulpe odredili nivo VEGF od 769 pg/ml. Ilić i sar. (2012) su
našli koncentraciju VEGF od 68 pg/mg u zubnoj pulpi zdravih osoba, a Roberts-Clark i Smith (2000) su u
rastvorljivoj frakciji dentina našli koncentraciju VEGF od 63 pg/mg. Koncentracija VEGF u pulpi 20 minuta
poslije primjene ozona na otvorene dentinske kanaliće zdravih zuba u trajanju od 40 sekundi je bila
značajno veća u poređenju sa vrijednošću koja je dobijena za kontrolnu pulpu i iznosila je 1023,4 pg/ml.
Povećanje nivoa VEGF u zubnoj pulpi ukazuje da ozon može da penetrira kroz dentinske kanaliće i ispolji
uticaj na tkivo pulpe poslije primjene u dubokim kavitetima. Prema nekim studijama ozon ispoljava
antibakterijsko djelovanje u debljini dentina do 2 mm (Hugh, 2005), ali bez horizontalne difuzije sa mjesta
primjene (Nakano i sar., 2012). Sa druge strane, važno je napomenuti da vodonik peroksid, jedan od
produkata raspadanja ozona, zbog rastvorljivosti u vodi i male molekulske mase, lako penetrira kroz
dentinske kanaliće do tkiva pulpe (Kwon i sar., 2013; Berger i sar., 2013).
Istraživanja pokazuju da ozon u krvi dovodi do povećanja koncentracije transformišućeg faktora rasta b1
(TGF-b1), faktora rasta trombocita (PDGF), interferona α, β i γ, interleukina 1, 2, 6 i 8 (Bocci i sar.,1998;
Bocci 1999; Bocci 2005; Re i sar., 2010). Kim i sar. (2009) su pokazali da lokalna primjena ozona na akutno
izazvano oštećenje kože eksperimentalnih životinja povećava nivo PDGF, TGF i VEGF i ubrzava zarastanje
oštećenog tkiva. Povećanje vaskularizacije i nivoa VEGF poslije primjene ozona povezuje se sa stvaranjem
ROS, produkata raspadanja ozona, i to u prvom redu vodonik peroksida. Poluživot vodonik peroksida u
DISKUSIJA
6.

69
krvi je veoma kratak, 0,5-1 minuta, jer biva neutralisan od strane antioksidativnog sistema organizma, ali
ipak dovoljno dug da aktivira brojne biološke procese među kojima i angiogenezu (Sagai i Bocci, 2011;
Pecorelli i sar., 2013). Pokazano je da ekstraćelijski vodonik peroksid stimuliše ekspresiju VEGF-A i VEGFR-
2 receptora (receptori za koje se VEGF-A vezuje)(Roy i sar., 2008). Intraćelijski vodonik peroksid je
neophodan za uspješnu propagaciju angiogenih signala koji nastaju poslije vezivanja VEGF-A za VEGFR-2 i
njegove sljedstvene aktivacije (Roy i sar., 2008).
VEGF je faktor rasta uključen u mnogim fiziološkim i patološkim procesima. Povećan nivo VEGF odgovoran
je za patološke promjene kod nekih bolesti, kao što su dijabetes melitus ili neoplazme, tako da je primarni
cilj u terapiji ovih oboljenja smanjenje efekata VEGF (prevenstveno angiogeneze) (Ho i sar., 2012, Eichten i
sar., 2013). Sa druge strane, povećanje nivoa VEGF, koje je značajno manje od patološki povećanog nivoa
VEGF, poželjno je tokom procesa zarastanja rana (Maulik, 2006). U tkivu pulpe VEGF je odgovoran za
angiogenezu koja prethodi formiranju reparativnog dentina kao i za diferencijaciju odontoblasta i njihovu
aktivnost (Matsushita i sar. 2000; Scheven i sar. 2008). Značajno je istaći da naši rezultati pokazuju da je
nivo VEGF u zdravoj, netretiranoj pulpi sličan nivou VEGF koji je dobijen u istim uslovima u drugim
studijama (Tran-Hung i sar., 2008; Ilić i sar., 2012). Ovaj nalaz najprije ukazuje na farmakokinetičko
svojstvo ozona i njegovih produkata da efikasno prolaze kroz dentinske kanaliće i dospjevaju do pulpnog
tkiva. Sa druge strane, povećan nivo VEGF od oko 24% u tkivu pulpe poslije primjene ozona korespondira
sa prolaznim povećanjem VEGF koje nastaje poslije mehaničke povrede pulpnog tkiva (oko 23%), kako su
to pokazali Tran-Hung i sar. (2008). Međutim, isti autori su pokazali značajno dozno zavisno povećanje
VEGF za oko 31% odnosno oko 49% poslije primjene 50 μM i 100 μM HEMA (monomer koji ulazi u sastav
dentalnih adheziva i kompozita) (Tran-Hung i sar., 2008). Imajući to u vidu, može se pretpostaviti da je
ozon biokompatibliniji u odnosu na HEMA. Na biokompatibilnost ozona još više ukazuje podatak da u toku
dijabetes melitusa tip 2  patološki porast VEGF u pulpi u odnosu na kontrolne uslove iznosi oko 33% (Ilić i
sar., 2012) što je znatno više od onog koji je dobijen poslije primjene ozona (oko 24%). Na kraju treba
istaći da povećani nivo VEGF zapažen u našoj studiji najvjerovatnije korespondira sa njegovim
remineralizacionim potencijalom, koji je zabilježen u pojedinim kliničkim studijama (Baysan i Lynch, 2004).
Uzimajući u obzir oksidativni potencijal ozona i stvaranje sekundarnih glasnika, ROS i produkata lipidne
oksidacije (engl. Lipid oxydation products (LOP)), od važnosti je ispitati njegov mogući uticaj na aktivnost
antioksidativnih enzima pulpe. SOD se smatra jednim od najvažnijih antioksidativnih enzima, čije je
prisustvo dokazano u tkivu pulpe u fiziološkim uslovima (Davis i sar., 1991; Bödör i sar., 2007). SOD ima
ulogu u zaštiti ćelija od nekroze i matriksa od degradacije što omogućava reparaciju tkiva tokom
inflamacije (Davis i sar., 1991). U ovom istraživanju nivo SOD u zdravoj pulpi kontrolnih zuba je iznosio
92% i bio je značajno veći od onog koji je zabilježen u pulpama izloženim djelovanju ozona (88,7%). U
većem broju istraživanja pokazano je da ponovljena primjena ozona u toku dužeg vremenskog perioda (od
nekoliko dana do nekoliko nedjelja) povećava antioksidativni status kod pacijenata sa koronarnom
bolešću i dijabetičnim stopalom posredstvom povećanja nivoa SOD i drugih antioksidativnih enzima
(Martínez-Sánchez i sar., 2005; Martínez-Sánchez i sar., 2012; Re i sar., 2014). Nasuprot tome, u našem
istraživanju ispitivan je neposredni efekat jednokratne primjene ozona. U vezi sa tim značajno je istaći da
poslije kontakta sa organskim materijama u krvi ozon veoma brzo nestaje (za 2 minute) uz stvaranje ROS i
LOP. Nastali ROS izaziva prolazno smanjenje antioksidativnog rezervoara krvi, za 2-25% u zavisnosti od
DISKUSIJA
6.

70
primijenjene doze, koje se koriguje za manje od 20 minuta (Bocci, 2005). Može se smatrati da je SOD u
pulpi smanjen za oko 3% zato što je to količina SOD koja je utrošena za smanjenje ROS izazvanog
jednokratnom primjenom ozona u preparisani kavitet zuba. Odsustvo povećanja nivoa SOD neposredno
poslije tretiranja ozonom indirektno ukazuje na činjenicu da preparacija kaviteta nije dovela do
inflamatornih promjena u pulpi, kako je nađeno u drugim studijama (Varvara i sar., 2012). Moguće je da bi
produžavanje opservacionog perioda, poslije jednostruke primjene, ili ponovljene aplikacije, kako je
preporučeno u terapiji karijesa, bilo povezano sa povećanjem nivoa antioksidativne zaštite, što bi ukazalo
na značajnu ulogu ozona u odgovoru pulpe na povredu i infekciju.

70
                                           Z A K LJ U Č C I

 7.
ZAKLJUČCI
7.

72
7. ZAKLJUČCI

1. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao
antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja aerobnih i anaerobnih bakterija. Rezultati
dobijeni kultivisanjem bakterija.
2. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao
antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja Lactobacillus spp. Rezultati dobijeni
kultivisanjem bakterija.
3. Nema razlike u učestalosti pojedinih vrsta Lactobacillus spp. poslije jednokratne primjene ozona u
preparisani kavitet zuba kao i primjene 2% hlorheksidina, kao antiseptika. Rezultati dobijeni kultivisanjem
bakterija.
4. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao
antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja bakterija Streptococcus spp.. Rezultati
dobijeni kultivisanjem bakterija.
5. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao
antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja anaerobnih bakterija. Rezultati dobijeni qPCR
metodom.
6. Jednokratna primjena ozona u preparisani kavitet zuba kao i primjena 2% hlorheksidina, kao
antiseptika, prouzrokuje značajno smanjenje ukupnog broja Lactobacillus spp.. Rezultati dobijeni qPCR
metodom.
7. Nema razlike u učestalosti vrste L. casei/paracasei poslije jednokratne primjene ozona kao i 2%
hlorheksidina, kao antiseptika u preparisani kavitet zuba. Rezultati dobijeni PCR metodom.
8. Komparativna analiza rezultata o antibakterijskoj efikasnosti jednokratno primjenjenog ozona i 2%
hlorheksidina u ispreparisan kavitet zuba pokazuje da su oba antiseptika podjednako efikasna.
9. Poslije jednokratne primjene ozona kao antiseptika u kavitet zuba nivo VEGF u tkivu zubne pulpe je
povećan u odnosu na kontrolne netretirane kavitete što ukazuje da ozon i njegovi produkti prolaze kroz
dentinske kanaliće i povećavaju nivo VEGF (farmakokinetički aspekt), kao i da je ta količina
biokompatibilna sa pulpnim tkivom; šta više da je taj VEGF uključen u procese reparativne dentinogeneze.
10. Poslije jednokratne primjene ozona kao antiseptika u kavitet zuba nivo SOD u tkivu zubne pulpe je za
oko 3% smanjen u odnosu na nivo u kontrolnim netretiranim kavitetima što ukazuje da je ozon aktivirao
antioksidativni sistem zubne pulpe.

73
                                         L I T E R A T U R A

 8.
LITERATURA
8.

74
8. LITERATURA

1. Aas JA, Griffen AL, Dardis SR, Lee AM, Olsen I, Dewhirst FE, Leys EJ, Paster BJ. Bacteria of dental caries
in primary and permanent teeth in children and young adults. J Clin Microbiol 2008;46:1407-1417.
2. Aldridge WN. The biochemical principles of toxicology. Exp Toxicol 1993;5:56–78.
3. Alkahtani A, Alkahtany SM, Anil S. An in vitro evaluation of the cytotoxicity of varying concentrations
of sodium hypochlorite on human mesenchymal stem cells. J Contemp Dent Pract 2014;15:473-481.
4. Almazin SM, Dziak R, Andreana S, Ciancio SG. The effect of doxycycline hyclate, chlorhexidine
gluconate, and minocycline hydrochloride on osteoblastic proliferation and differentiation in vitro. J
Periodontol 2009;80:999-1005.
5. Al-Omari WM, Al-Omari QD, Omar R. Effect of cavity disinfection on postoperative sensitivity
associated with amalgam restorations. Oper Dent 2006;31:165-170.
6. Al-Zayer MA, Straffon LH, Feigal RJ, Welch KB. Indirect pulp treatment of primary posterior teeth: a
retrospective study. Pediatr Dent 2003;25:29-36.
7. Amaral KF, Rogero MM, Fock RA, Borelli P, Gavini G. Cytotoxicity analysis of EDTA and citric acid
applied on murine resident macrophages culture. Int Endod J 2007;40:338-343.
8. Aranha AM, Zhang Z, Neiva KG, Costa CA, Hebling J, Nör JE. Hypoxia enhances the angiogenic potential
of human dental pulp cells. J Endod 2010;36:1633-1637.
9. Artese L, Corrado R, Ferrero G, Fiorini M, Santinelli A, Piatelli A. Vascular endothelial growth factor
(VEGF) expression in healthy and inﬂamed human dental pulps. J Endod 2002;28:20–23.
10. Aslantas EE, Buzoglu HD, Altundasar E, Serper A. Effect of EDTA, sodium hypochlorite, and
chlorhexidine gluconate with or without surface modifiers on dentin microhardness. J Endod
2014;40:876-879.
11. Atabek D, Oztas N. Effectiveness of Ozone with or without the Additional Use of Remineralizing
Solution on Non-Cavitated Fissure Carious Lesions in Permanent Molars. Eur J Dent 2011;5:393-399.
12. Ates M, Akdeniz BG, Sen BH. The effect of calcium chelating or binding agents on Candida albicans.
Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2005;100:626-630.
13. Ayna B, Celenk S, Atakul F, Sezgin B, Ozekinci T. Evaluation of clinical and microbiological features of
deep carious lesions in primary molars. J Dent Child (Chic) 2003;70:15-18.
14. Azarpazhooh A, Limeback H. The application of ozone in dentistry: a systematic review of literature. J
Dent 2008;36:104-116.
15. Babich H, Wurzburger BJ, RubinYL, Sinensky MC, Blau L. An in vitro study on the cytotoxicity of
chlorhexidine digluconate to human gingival cells. Cell Biol Toxicol 1995;11:79-88.
16. Ballal NV, Kundabala M, Bhat S, Rao N, Rao BS. A comparative in vitro evaluation of cytotoxic effects
of EDTA and maleic acid: root canal irrigants. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod
2009;108:633-638.
LITERATURA
8.

75
17. Ballal NV, Yegneswaran PP, Mala K, Bhat KS. In vitro antimicrobial activity of maleic acid and
ethylenediaminetetraacetic acid on endodontic pathogens. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod 2011;112:696-700.
18. Barnhart BD, Chuang A, Lucca JJ, Roberts S, Liewehr F, Joyce AP. An in vitro evaluation of the
cytotoxicity of various endodontic irrigants on human gingival fibroblasts. J Endod 2005;31:613-615.
19. Baumgardner KR, Law AS, Gebhart GF. Localization and changes in superoxide dismutase
immunoreactivity in rat pulp after tooth preparation. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod 1999;88:488-495.
20. Baysan A, Lynch E. Clinical reversal of root caries using ozone: 6-month results. Am J Dent
2007;20:203-208.
21. Baysan A, Lynch E. Effect of ozone on the oral microbiota and clinical severity of primary root caries.
Am J Dent 2004;17:56-60.
22. Baysan A, Whiley RA, Lynch E. Antimicrobial effect of a novel ozone-generating device on micro-
organisms associated with primary root carious lesions in vitro. Caries Res 2000;34:498-501.
23. Beighton D. The complex oral microflora of high-risk individuals and groups and its role in the caries
process. Community Dent Oral Epidemiol 2005;33:248-255.
24. Beltz RE, Torabinejad M, Pouresmail M. Quantitative analysis of the solubilizing action of MTAD,
sodium hypochlorite, and EDTA on bovine pulp and dentin. J Endod 2003;29:334-337.
25. Berger SB, Tabchoury CP, Ambrosano GM, Giannini M. Hydrogen peroxide penetration into the pulp
chamber and dental permeability after bleaching. Gen Dent 2013;61:e21-25.
26. Berkovitz KB, Holland GR, Moxham BJ. Oral anatomy, histology and embryology. Mosby St. Louis, MD,
USA; 2009.
27. Bernardi A, Teixeira CS. The properties of chlorhexidine and undesired effects of its use in
endodontics. Quintessence Int 2015;46:575-582.
28. Bezirtzoglou E, Cretoiu SM, Moldoveanu M, Alexopoulos A, Lazar V, Nakou M. A quantitative
approach to the effectiveness of ozone against microbiota organisms colonizing toothbrushes. J Dent
2008;36:600-605.
29. Bjørndal L, Reit C, Bruun G, Markvart M, Kjaeldgaard M, Näsman P, Thordrup M, Dige I, Nyvad B,
Fransson H, Lager A, Ericson D, Petersson K, Olsson J, Santimano EM, Wennström A, Winkel P, Gluud
C. Treatment of deep caries lesions in adults: randomized clinical trials comparing stepwise vs. direct
complete excavation, and direct pulp capping vs. partial pulpotomy. Eur J Oral Sci 2010;118:290-297.
30. Bjørndal L, Larsen T, Thylstrup A. A clinical and microbiological study of deep carious lesions during
stepwise excavation using long treatment intervals. Caries Res 1997;31:411-417.
31. Bjørndal L, Larsen T. Changes in the cultivable flora in deep carious lesions following a stepwise
excavation procedure. Caries Res 2000;34:502-508.
32. Bocci V, Valacchi G, Corradeschi F, Aldinucci C, Silvestri S, Paccagnini E, Gerli R. Studies on the
biological effects of ozone. Generation of reactive oxygen species (ROS) after exposure of human
blood to ozone. J Biol Regul Homeost Agents 1998;12:67-75.
33. Bocci V. Biological and clinical effects of ozone. Has ozonetherapy a future in medicine? Br J Biomed
Sci 1999;56:270–279.
34. Bocci V. Ozone-A new medical drug. Springer Dordrecht, The Netherlands; 2005
LITERATURA
8.

76
35. Bödör C, Matolcsy A, Bernáth M. Elevated expression of Cu, Zn-SOD and Mn-SOD mRNA in inflamed
dental pulp tissue. Int Endod J 2007;40:128-132.
36. Bönecker M, Toi CS, Cleaton-Jones P. Mutans streptococci and lactobacilli in carious dentine before
and after Atraumatic Restorative Treatment. J Dent 2003;31:423-428.
37. Borges FM, de Melo MA, Lima JP, Zanin IC, Rodrigues LK. Antimicrobial effect of chlorhexidine
digluconate in dentin: In vitro and in situ study. J Conserv Dent 2012;15:22-26.
38. Bortolotto T, Doudou W, Stavridakis M, Ferrari M, Krejci I. Marginal adaptation after aging of a self-
etching adhesive containing an antibacterial monomer. J Adhes Dent 2007;9:311-317.
39. Botelho MG. The minimum inhibitory concentration of oral antibacterial agents against cariogenic
organisms. Microbios 2000;103:31-41.
40. Brannstrom M, Nyborg H. Cavity treatment with a microbicidal fluoride solution: Growth of bacteria
and effect on the pulp. J Prosthet Dent 1973;30:303-310.
41. Bratthall D. Estimation of global DMFT for 12-year-olds in 2004. Int Dent J 2005;55:370-372.
42. Buczko P, Zalewska A, Szarmach I. Saliva and oxidative stress in oral cavity and in some systemic
disorders. J Physiol Pharmacol 2015;66:3-9.
43. Byrne AM, Bouchier-Hayes DJ, Harmey JH. Angiogenic and cell survival functions of vascular
endothelial growth factor (VEGF). J Cell Mol Med 2005;9:777–794.
44. Byun R, Nadkarni MA, Chhour KL, Martin FE, Jacques NA, Hunter N. Quantitative analysis of diverse
Lactobacillus species present in advanced dental caries. J Clin Microbiol 2004;42:3128-3136.
45. Cadenaro M, Breschi L, Antoniolli F, Mazzoni A, Di Lenarda R. Influence of whitening on the degree of
conversion of dental adhesives on dentin. Eur J Oral Sci 2006;114:257-262.
46. Cadenaro M, Delise C, Antoniollo F, Navarra OC, Di Lenarda R, Breschi L. Enamel and dentin bond
strength following gaseous ozone application. J Adhes Dent 2009;11:287-292.
47. Casagrande L, Bento LW, Dalpian DM, García-Godoy F, de Araujo FB. Indirect pulp treatment in
primary teeth: 4-year results. Am J Dent 2010;21:34-38.
48. Castillo A, Galindo-Moreno P, Avila G, Valderrama M, Liébana J, Baca P. In vitro reduction of mutans
streptococci by means of ozone gas application. Quintessence Int 2008;39:827-831.
49. Celiberti P, Pazera P, Lussi A. The impact of ozone treatment on enamel physical properties. Am J Dent
2006;19:67-72.
50. Celik C, Ozel Y, Bagis B, Erkut S. Effect of laser irradiation and cavity disinfectant application on the
microtensile bond strength of different adhesive systems. Photomed Laser Surg 2010;28:267-272.
51. Chang YE, Shin DH. Effect of chlorhexidine application methods on microtensile bond strength to
dentin in Class I cavities. Oper Dent 2010;35:618-623.
52. Chhour KL, Nadkarni MA, Byun R, Martin FE, Jacques NA, Hunter N. Molecular analysis of microbial
diversity in advanced caries. J Clin Microbiol 2005;43:843-849.
53. Corralo DJ, Maltz M. Clinical and ultrastructural effects of different liners/restorative materials on
deep carious dentin: a randomized clinical trial. Caries Res 2013;47:243-250.
54. Costa CA, Ribeiro AP, Giro EM, Randall RC, Hebling J. Pulp response after application of two resin
modified glass ionomer cements (RMGICs) in deep cavities of prepared human teeth. Dent Mater
2011;27:e158-170.
LITERATURA
8.

77
55. Cox CF, Hafez AA, Akimoto N, Otsuki M, Suzuki S, Tarim B. Biocompatibility of primer, adhesive and
resin composite systems on non-exposed and exposed pulps on non-human primates. Am J Dent
1998;10:55-63.
56. Cox CF, Keall CL, Keall H, Ostro E, Bergenholtz G. Biocompatibility of surface-sealed dental materials
against exposed dental pulps. J Prosthet Dent 1987;57:1–8.
57. Dähnhardt JE, Jaeggi T, Lussi A. Treating open carious lesions in anxious children with ozone. A
prospective controlled clinical study. Am J Dent 2006;19:267-270.
58. Davis WL, Jacoby BH, Craig KR, Wagner G, Harrison JW. Copper-zinc superoxide dismutase activity in
normal and inflamed human dental pulp tissue. J Endod 1991;17:316-318.
59. de Souza LB, de Aquino SG, de Souza PP, Hebling J, Costa CA. Cytotoxic effects of different
concentrations of chlorhexidine. Am J Dent 2007;20:400-404.
60. Di Lenarda R, Cadenaro M, Sbaizero O. Effectiveness of 1 mol L-1 citric acid and 15% EDTA irrigation
on smear layer removal. Int Endod J 2000;33:46-52.
61. Dolezel J, Bartos J, Voglmayr H, Greilhuber J. Nuclear DNA content and genome size of trout and
human. Cytometry A 2003;51:127–128.
62. Duggal MS, Nikolopoulou A, Tahmassebi JF. The additional effect of ozone in combination with
adjunct remineralisation products on inhibition of demineralisation of the dental hard tissues in situ. J
Dent 2012;40:934-940.
63. Dukić W, Jurić H, Andrašević AT, Kovačević V, Dukić OL, Delija B. The efficacy of gaseous ozone on
some cariogenic bacteria. Coll Antropol 2013;37:109-113.
64. Dumitrescu AL. Antibiotics and Antiseptics in Periodontal Therapy. Springer-Verlag, Berlin; 2011.
65. Duque C, Negrini Tde C, Sacono NT, Spolidorio DM, de Souza Costa CA, Hebling J. Clinical and
microbiological performance of resin-modified glass-ionomer liners after incomplete dentine caries
removal. Clin Oral Investig 2009;13:465-471.
66. Eichten A, Adler AP, Cooper B, Griffith J, Wei Y, Yancopoulos GD, Lin HC, Thurston G.Rapid decrease in
tumor perfusion following VEGF blockade predicts long-term tumor growth inhibition in preclinical
tumor models. Angiogenesis 2013;16:429-441.
67. Eimar H, Siciliano R, Abdallah MN, Nader SA, Amin WM, Martinez PP, Celemin A, Cerruti M, Tamimi F.
Hydrogen peroxide whitens teeth by oxidizing the organic structure. J Dent 2012;40(Suppl 2):e25-33.
68. Eldeniz AU, Erdemir A, Belli S. Effect of EDTA and citric acid solutions on the microhardness and the
roughness of human root canal dentin. J Endod 2005;31:107-110.
69. Emilson CG. Susceptibility of various microorganisms to chlorhexidine. Scand J Dent Res 1977;85:255-
265.
70. Ercan E, Erdemir A, Zorba YO, Eldeniz AU, Dalli M, Ince B, Kalaycioglu B. Effect of different cavity
disinfectants on shear bond strength of composite resin to dentin. J Adhes Dent 2009;11:343-346.
71. Erdemir A, Ari H, Güngüneş H, Belli S. Effect of medications for root canal treatment on bonding to
root canal dentin. J Endod 2004;30:113-116.
72. Ergücü Z, Hiller KA, Schmalz G. Influence of dentin on the effectiveness of antibacterial agents. J
Endod 2005;31:124-129.
73. Ersin NK, Uzel A, Aykut A, Candan U, Eronat C. Inhibition of cultivable bacteria by chlorhexidine
treatment of dentin lesions treated with the ART technique. Caries Res 2006;40:172-177.
LITERATURA
8.

78
74. Faul F, Erdfelder E, Lang AG, Buchner A. G*Power 3: A flexible statistical power analysis program for
the social, behavioral, and biomedical sciences. Behav Res Methods 2007;39:175-191.
75. Fogel GB, Collins CR, Li J, Brunk CF. Prokaryotic Genome Size and SSU rDNA Copy Number: Estimation
of Microbial Relative Abundance from a Mixed Population. Microb Ecol 1999;38:93-113.
76. Franzon R, Guimaraes LF, Magalhaes CE, Haas AN, Araujo. Outcomes of one-step incomplete and
complete excavation in primary teeth: 24-month randomized controlled trial. Caries Res 2014;48:376-
383.
77. Frencken JE, Imazato S, Toi C, Mulder J, Mickenautsch S, Takahashi Y, Ebisu S. Antibacterial effect of
chlorhexidine-containing glass ionomer cement in vivo: a pilot study. Caries Res 2007;41:102-107.
78. Fure S, Emilson CG. Effect of chlorhexidine gel treatment supplemented with chlorhexidine varnish
and resin on mutans streptococci and Actinomyces on root surfaces. Caries Res 1990;24:242-247.
79. Giannelli M, Chellini F, Margheri M, Tonelli P, Tani A. Effect of chlorhexidine digluconate on different
cell types: a molecular and ultrastructural investigation. Toxicol In Vitro 2008;22:308-317.
80. Gomes BP, Vianna ME, Zaia AA, Almeida JF, Souza-Filho FJ, Ferraz CC. Chlorhexidine in endodontics.
Braz Dent J 2013;24:89-102.
81. Grando Mattuella L, Westphalen Bento L, de Figueiredo JA, Nör JE, de Araujo FB, Fossati AC. Vascular
endothelial growth factor and its relationship with the dental pulp. J Endod 2007;33:524-530.
82. Grawehr M, Sener B, Waltimo T, Zehnder M. Interactions of ethylenediamine tetraacetic acid with
sodium hypochlorite in aqueous solutions. Int Endod J 2003;36:411-417.
83. Gross EL, Leys EJ, Gasparovich SR, Firestone ND, Schwartzbaum JA, Janies DA, Asnani K, Griffen AL.
Bacterial 16S sequence analysis of severe caries in young permanent teeth. J Clin Microbiol 2010;
48:4121-4128.
84. Gruythuysen RJ, van Strijp AJ, Wu MK. Long-term survival of indirect pulp treatment performed in
primary and permanent teeth with clinically diagnosed deep carious lesions. J Endod 2010;36:1490-
1493.
85. Gu F, Bresciani E, Barata TJ, Fagundes TC, Navarro MF, Dickens SH, Fenno JC, Peters MC. In vivo acid
etching effect on bacteria within caries-affected dentin. Caries Res 2010;44:472-477.
86. Gupta G, Mansi B. Ozone therapy in periodontics. J Med Life 2012;5:59-67.
87. Gurgan S, Yalcin Cakir F. The effect of three different mouthrinses on the surface hardness, gloss and
colour change of bleached nano composite resins. Eur J Prosthodont Restor Dent 2008;16:104-108.
88. Hafez AA, Cox CF, Tarim B, Otsuki M, Akimoto N. An in vivo evaluation of hemorrhage control using
sodium hypochlorite and direct capping with a one- or two-component adhesive system in exposed
nonhuman primate pulps. Quintessence Int 2002;33:261-272.
89. Hamada S, Slade HD. Biology, immunology, and cariogenicity of Streptococcus mutans. Microbiol Rev
1980;44:331-384.
90. Hauser-Gerspach I, Pfäffli-Savtchenko V, Dähnhardt JE, Meyer J, Lussi A. Comparison of the immediate
effects of gaseous ozone and chlorhexidine gel on bacteria in cavitated carious lesions in children in
vivo. Clin Oral Investig 2009;13:287-291.
91. Hayashi M, Fujitani M, Yamaki C, Momoi Y. Ways of enhancing pulp preservation by stepwise
excavation-a systematic review. J Dent 2011;39:95-107.
92. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res 1996;6:986-994.
LITERATURA
8.

79
93. Ho AC, Scott IU, Kim SJ, Brown GC, Brown MM, Ip MS, Recchia FM. Anti-vascular endothelial vascular
growth factor pharmacotherapy for diabetic macular edema: a report by the American Academy of
Ophthalmology. Ophthalmology 2012;119:2179-2188.
94. Holmes J. Clinical reversal of root caries using ozone, double-blind, randomized, controlled 18-month
trial. Gerodontology 2003;20:106-114.
95. Hosoya Y, Ando S, Yamaguchi K, Oooka S, Miyazaki M, Tay FR. Quality of the interface of primary
tooth dentine bonded with antibacterial fluoride-releasing adhesive. J Dent 2010;38:423-430.
96. Hugh D. Ozone therapy for the treatment of caries. In: Operative Dentistry: a practical guide to recent
innovations. Springer-Verlag, Berlin; 2006
97. Huth KC, Paschos E, Brand K, Hickel R. Effect of ozone on non-cavitated fissure carious lesions in
permanent molars. A controlled prospective clinical study. Am J Dent 2005;18:223-228.
98. Huth KC, Jakob FM, Saugel B, Cappello C, Paschos E, Hollweck R, Hickel R, Brand K. Effect of ozone on
oral cells compared with established antimicrobials. Eur J Oral Sci 2006;114:435-440.
99. Huth KC, Saugel B, Jakob FM, Cappello C, Quirling M, Paschos E, Ern K, Hickel R, Brand K. Effect of
aqueous ozone on the NF-kappaB system. J Dent Res 2007;86:451-456.
100.
Ikai H, Nakamura K, Shirato M, Kanno T, Iwasawa A, Sasaki K, Niwano Y, Kohno M. Photolysis of
hydrogen peroxide, an effective disinfection system via hydroxyl radical formation. Antimicrob Agents
Chemother 2010;54:5086-5091.
101.
Ilić J, Radović K, Roganović J, Brković B, Stojić D. The levels of vascular endothelial growth factor
and bone morphogenetic protein 2 in dental pulp tissue of healthy and diabetic patients. J Endod
2012;38:764-768.
102.
Imazato S, Tay FR, Kaneshiro AV, Takahashi Y, Ebisu S. An in vivo evaluation of bonding ability of
comprehensive antibacterial adhesive system incorporating MDPB. Dent Mater 2007;23:170-176.
103. Imazato S, Torii Y, Takatsuka T, Inoue K, Ebi N, Ebisu S. Bactericidal effect of dentin primer containing
antibacterial monomer methacryloxydodecylpyridinium bromide (MDPB) against bacteria in human
carious dentin. J Oral Rehabil 2001;28:314-319.
104. Imazato S. Antibacterial properties of resin composites and dentin bonding systems. Dent Mater
2003;19:449-457.
105. ISO 10993. Biological evaluation of dental devices. International Standards Organization 1992.
106. ISO 7405. Dentistry-Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry-Test
methods for dental materials. International Standards Organization 1996.
107. Ittatirut S, Matangkasombut O, Thanyasrisung P. In-office bleaching gel with 35% hydrogen peroxide
enhanced biofilm formation of early colonizing streptococci on human enamel. J Dent 2014;42:1480-
1486.
108. Järvinen H, Tenovuo J, Huovinen P. In vitro susceptibility of Streptococcus mutans to chlorhexidine and
six other antimicrobial agents. Antimicrob Agents Chemother 1993;37:1158-1159.
109. Johansson E, Claesson R, van Dijken JW. Antibacterial effect of ozone on cariogenic bacterial species. J
Dent 2009;37:449-453.
110. Johansson E, van Dijken JW, Karlsson L, Andersson-Wenckert I. Treatment effect of ozone and fluoride
varnish application on occlusal caries in primary molars: a 12-month study. Clin Oral Investig
2014;18:1785-1792.
LITERATURA
8.

80
111. Jones CG. Chlorhexidine: is it still the gold standard? Periodontol 2000 1997;15:55-62.
112. Kapdan A, Oztas N. Effects of chlorhexidine and gaseous ozone on microleakage and on the bond
strength of dentin bonding agents with compomer restoration on primary teeth. J Dent Sci
2015;10:46-54.
113. Khadre MA, Youself AE, Kim JG. Microbiological Aspects of Ozone Applications in Food: A Review.
Journal of Food Science 2001;66:1242-1252.
114. Kianoush N, Adler CJ, Nguyen KYT, Browne GV, Simonian M, Hunter N. Bacterial profile of dentine
caries and the impact of pH on bacterial population diversity. PLoS One 2014;9:e92940.
115. Kidd EA, Joyston-Bechal S, Beighton D. Microbiological validation of assessments of caries activity
during cavity preparation. Caries Res 1993;27:402-408.
116. Kim HS, Noh SU, Han YW, Kim KM, Kang H, Kim HO, Park YM. Therapeutic effects of topical application
of ozone on acute cutaneous wound healing. J Korean Med Sci 2009;24:368-374.
117. Klinke T, Klimm W, Gutknecht N. Antibacterial effects of Nd:YAG laser irradiation within root canal
dentin. J Clin Laser Med Surg 1997;15:29-31.
118. Knight GM, McIntyre JM, Craig GG, Mulyani, Zilm PS. The inability of Streptococcus mutans and
Lactobacillus acidophilus to form a biofilm in vitro on dentine pretreated with ozone. Aust Dent J
2008;53:349-353.
119. Kollmuss M, Kist S, Obermeier K, Pelka AK, Hickel R, Huth KC. Antimicrobial effect of gaseous and
aqueous ozone on caries pathogen microorganisms grown in biofilms. Am J Dent 2014;27:134-138.
120. Korkmaz Y, Ozalp M, Attar N. Comparison of the antibacterial activity of different self-etching primers
and adhesives. J Contemp Dent Pract 2008;9:57-64.
121. Kwon SR, Oyoyo U, Li Y. Effect of light activation on tooth whitening efficacy and hydrogen peroxide
penetration: an in vitro study. J Dent. 2013;41(Suppl 3):e39-45.
122. Lafuente D. SEM analysis of hybrid layer and bonding interface after chlorhexidine use. Oper Dent
2012;37:172-180.
123. Lai S, Mak Y, Cheung G, Osorio R, Toledano M, Carvalho R, Tay F, Pashley DH. Reversal of
compromised bonding to oxidized etched dentin. J Dent Res 2001;80:1919-1924.
124. Lee TH, Hu CC, Lee SS, Chou MY, Chang YC. Cytotoxicity of chlorhexidine on human osteoblastic cells is
related to intracellular glutathione levels. Int Endod J 2010;43:430-435.
125. Li F, Chen J, Chai Z, Zhang L, Xiao Y, Fang M, Ma S. Effects of a dental adhesive incorporating
antibacterial monomer on the growth, adherence and membrane integrity of Streptococcus mutans. J
Dent 2009;37:289-296.
126. Li J, Helmerhorst EJ, Leone CW, Troxler RF, Yaskell T, Haffajee AD, Socransky SS, Oppenheim FG.
Identification of early microbial colonizers in human dental biofilm. J Appl Microbiol 2004;97:1311-
1318.
127. Lima JP, Sampaio de Melo MA, Borges FM, Teixeira AH, Steiner-Oliveira C, Nobre Dos Santos M,
Rodrigues LK, Zanin IC. Evaluation of the antimicrobial effect of photodynamic antimicrobial therapy
in a situ model of dentine caries. Eur J Oral Sci 2009;117:568-574.
128. Lima KC, Coelho LT, Pinheiro IVA, Rocas IN, Siqueira Jr JF. Microbiota of dentinal caries as assessed by
reverse-capture checkerboard analysis. Caries Res 2011;45:21-30.
LITERATURA
8.

81
129. Lindblad RM, Lassila LV, Salo V, Vallittu PK, Tjäderhane L. One year effect of chlorhexidine on bonding
of fibre-reinforced composite root canal post to dentine. J Dent 2012;40:718-722.
130. Loesche WJ. Chemotherapy of dental plaque infections. Oral Sci Rev 1976;9:65-107.
131. Lula EC, Almeida LJ Jr, Alves CM, Monteiro-Neto V, Ribeiro CC. Partial caries removal in primary teeth:
association of clinical parameters with microbiological status. Caries Res 2011;45:275-280.
132. Lula EC, Monteiro-Neto V, Alves CM, Ribeiro CC. Microbiological analysis after complete or partial
removal of carious dentin in primary teeth: a randomized clinical trial. Caries Res 2009;43:354-358.
133. Magni E, Ferrari M, Hickel R, Ilie N. Influence of gasiform ozone on the micromechanical properties of
dentin. Int Dent SA 2010;11:16-21.
134. Magni E, Ferrari M, Papacchini F, Hickel R, Ilie N. Influence of ozone on the composite-to-composite
bond. Clin Oral Investig 2011;15:249-256.
135. Maltz M, de Oliveira EF, Fontanella V, Bianchi R. A clinical, microbiologic, and radiographic study of
deep caries lesions after incomplete caries removal. Quintessence Int 2002;33:151-159.
136. Maltz M, Garcia R, Jardim JJ, de Paula LM, Yamaguti PM, Moura MS, Garcia F, Nascimento C, Oliveira
A, Mestrinho HD. Randomized trial of partial vs. stepwise caries removal: 3-year folow-up. J Dent Res
2012a;91:1026-1031.
137. Maltz M, Henz SL, de Oliveira EF, Jardim JJ. Conventional caries removal and sealed caries in
permanent teeth: a microbiological evaluation. J Dent 2012b;40:776-782.
138. Maltz M, Jardim JJ, Mestrinho HD, Yamaguti PM, Podestá K, Moura MS, de Paula LM. Partial removal
of carious dentine: a multicentre randomized controlled trial and 18-month follow-up results. Caries
Res 2013;47:103-109.
139. Mantellini MG, Botero T, Yaman P, Dennison JB, Hanks CT, Nör JE. Adhesive resin and the hydrophilic
monomer HEMA induce VEGF expression on dental pulp cells and macrophages. Dent Mater
2006;22:434–440.
140. Mariotti AJ, Rumpf DA. Chlorhexidine-induced changes to human gingival fibroblast collagen and non-
collagen protein production. J Periodontol 1999;70:1443-1448.
141. Marsh PD, Featherstone A, McKee AS, Hallsworth AS, Robinson C, Weatherell JA, Newman HN, Pitter
AF. A microbiological study of early caries of aproximal surfaces in schoolchildren. J Dent Res
1989;68:1151-1154.
142. Marsh PD. Are dental diseases examples of ecological catastrophes? Microbiology 2003;149:279-294.
143. Martin FE, Nadkarani MA, Jacques NA, Hunter N. Quantitative microbiological study of human carious
dentine by culture and real-time PCR: association of anaerobes with histopathological changes in
chronic pulpitis. J Clin Microbiol 2002;40:1698-1704.
144. Martínez-Sánchez G, Al-Dalain SM, Menéndez S, Re L, Giuliani A, Candelario-Jalil E, Alvarez H,
Fernández-Montequín JI, León OS. Therapeutic efficacy of ozone in patients with diabetic foot. Eur J
Pharmacol 2005;523:151-161.
145. Martínez-Sánchez G, Delgado-Roche L, Díaz-Batista A, Pérez-Davison G, Re L. Effects of ozone therapy
on haemostatic and oxidative stress index in coronary artery disease. Eur J Pharmacol 2012;691:156-
162.
146. Massara ML, Alves JB, Brandão PR. Atraumatic restorative treatment: clinical, ultrastructural and
chemical analysis. Caries Res 2002;36:430-436.
LITERATURA
8.

82
147. Matsushita K, Motani R, Sakuta T, Nagaoka S, Matsuyama T, Abeyama K, Maruyama I, Takada H, Torii
M. Lipopolysaccharide enhances the production of vascular endothelial growth factor by human pulp
cells in culture. Infect Immun 1999;67:1633-1639.
148. Matsushita K, Motani R, Sakuta T, Yamaguchi N, Koga T, Matsuo K, Nagaoka S, Abeyama K, Maruyama
I, Torii M. The role of vascular endothelial growth factor in human dental pulp cells: Induction of
chemotaxis, proliferation, and differentiation and activation of the AP-1-dependent signalling
pathway. J Dent Res 2000;79:1596-1603.
149. Matsuzaka K, Muramatsu T, Katakura A, Ishihara K, Hashimoto S, Yoshinari M, Endo T, Tazaki M,
Shintani M, Sato Y, Inoue T. Changes in the homeostatic mechanism of dental pulp with age:
expression of the core-binding factor alpha-1, dentin sialoprotein, vascular endothelial growth factor,
and heat shock protein 27 messenger RNAs. J Endod 2008;34:818-821.
150. Maulik N. Reactive oxygen species drives myocardial angiogenesis? Antioxid Redox Signaling
2006;8:2161-2168.
151. McDonnell G, Russell AD. Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance. Clin Microbiol
Rev 1999;12:147-179.
152. Meiers JC, Kresin JC. Cavity disinfectants and dentin bonding. Oper Dent 1996;21:153-159.
153. Mertz-Fairhurst EJ, Curtis JW, Ergle JW, Rueggeberg FA, Adair SM. Ultraconservative and cariostatic
sealed restorations: results at year 10. J Am Dent Assoc 1998;129:55-66.
154. Mohammadi Z. Sodium hypochlorite in endodontics: an update review. Int Dent J 2008;58:329-341.
155. Müller P, Guggenheim B, Schmidlin PR. Efficacy of gasiform ozone and photodynamic therapy on a
multispecies oral biofilm in vitro. Eur J Oral Sci 2007;115:77-80.
156. Munson M A, Banerjee A, Watson T F, Wade WG. Molecular analysis of the microflora associated with
dental caries. J Clin Microbiol 2004;42:3023-3029.
157. Nadkarni MA, Martin FE, Jacques NA, Hunter N. Determination of bacterial load by real-time PCR
using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology 2002;148(Pt 1):257-266.
158. Nagayoshi M, Fukuizumi T, Kitamura C, Yano J, Terashita M, Nishihara T. Efﬁcacy of ozone on survival
and permeability of oral microorganisms. Oral Microbiol Immunol 2004;19:240–246.
159. Nakano M, Takao A, Ozawa T, Igarashi T, Maeda N. Hosoya N. Microbicidal effect of ozone gas in vitro:
interaction with organic compounds and endodontic irrigation agents. Asian Pac J Dent 2012;12:21-
25.
160. Nikaido T, Nakabayashi N. Relationship between polymerization and adhesion to teeth. Adhesive Dent
1988;6:229–234.
161. Nishitani Y, Yoshiyama M, Tay FR, Wadgaonkar B, Waller J, Agee K, Pashley DH. Tensile strength of
mineralized/demineralized human normal and carious dentin. J Dent Res 2005;84:1075-1078.
162. Noguchi F, Kitamura C, Nagayoshi M, Chen KK, Terashita M, Nishihara T. Ozonated water improves
lipopolysaccharide-induced responses of an odontoblast-like cell line. J Endod 2009;35:668-672.
163. Nygaard-Ostby B. Chelation in root canal therapy: ethylendiaminetetraacetic acid for cleansing and
widening of root canals. Odontol Tidskr 1957;65:3-11.
164. Obata J, Takeshita T, Shibata Y, Yamanaka W, Unemori M, Akamine A, Yamasita Y. Identification of the
microbiota in carious dentin lesions using 16S rRNA gene sequencing. PLoS One 2014;9:e103712.
LITERATURA
8.

83
165. Oliveira LD, Carvalho CA, Nunes W, Valera MC, Camargo CH, Jorge AO. Effects of chlorhexidine and
sodium hypochlorite on the microhardness of root canal dentin. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol Endod 2007;104:e125-128.
166. Orhan AI, Oz FT, Ozcelik B, Orhan K. A clinical and microbiological comparative study of deep carious
lesion treatment in deciduous and young permanent molars. Clin Oral Investig 2008;12:369-378.
167. Paddick JS, Brailsford SR, Kidd EA, Beighton D. Phenotypic and genotypic selection of microbiota
surviving under dental restorations. Appl Environ Microbiol 2005;71:2467-2472.
168. Pappas M, Burns DR, Moon PC, Coffey JP. Influence of a 3-step tooth disinfection procedure on dentin
bond strength. J Prosthet Dent 2005;93:545-550.
169. Paranjpe A, Cacalano NA, Hume WR, Jewett A. N-acetylcysteine protects dental pulp stromal cells
from HEMA-induced apoptosis by inducing differentiation of the cells. Free Radic Biol Med
2007;43:1394–1408.
170. Paraskeva P, Graham NJD. Ozonation of municipal wastewater effluents. Water Environ Res 2002;74:
569–581.
171. Pascon FM, Kantovitz KR, Sacramento PA, Nobre-dos-Santos M, Puppin-Rontani RM. Effect of sodium
hypochlorite on dentine mechanical properties. A review. J Dent 2009;37:903-908.
172. Pecorelli A, Bocci V, Acquaviva A, Belmonte G, Gardi C, Virgili F, Ciccoli L, Valacchi G. NRF2 activation is
involved in ozonated human serum upregulation of HO-1 in endothelial cells. Toxicol Appl Pharmacol
2013;267:30-40.
173. Petersen PE, Bourgeois D, Ogawa H, Estupinan-Day S, Ndiaye C. The global burden of oral diseases and
risks to oral health. Bull World Health Organ 2005;83:661-669.
174. Phonghanyudh A, Phantumvanit P, Songpaisan Y, Petersen PE. Clinical evaluation of three caries
removal approaches in primary teeth: a randomised controlled trial. Community Dent Health
2012;29:173-178.
175. Polydorou O, Halili A, Wittmer A, Pelz K, Hahn P. The antibacterial effect of gas ozone after 2 months
of in vitro evaluation. Clin Oral Investig 2012;16:545-550.
176. Polydorou O, Pelz K, Hahn P. Antibacterial effect of an ozone device and its comparison with two
dentin -bonding systems. Eur J Oral Sci 2006;114:349-353.
177. Re L, Martínez-Sánchez G, Bordicchia M, Malcangi G, Pocognoli A, Morales-Segura MA, Rothchild J,
Rojas A. Is ozone pre-conditioning effect linked to Nrf2/EpRE activation pathway in vivo? A preliminary
result. Eur J Pharmacol 2014;742:158-162.
178. Re L, Martínez-Sánchez G, Perez-Davison G, Sirito M. Role of ozone/oxygen in fibroblast growth factor
activation. Discovering the facts. International Journal of Ozone Therapy 2010;9:55-58.
179. Rees TD, Orth CF. Oral ulcerations with use of hydrogen peroxide. J Periodontol 1986;57:689-692.
180. Ricci HA, Sanabe ME, de Souza Costa CA, Pashley DH, Hebling J. Chlorhexidine increases the longevity
of in vivo resin-dentin bonds. Eur J Oral Sci 2010;118:411-416.
181. Ricketts DN, Lamont T, Innes NP, Kidd E, Clarkson JE. Operative caries management in adults and
children. Cochrane Database Syst Rev 2013;3:CD003808
182. Ricketts DN, Kidd EA, Innes N, Clarkson J. Complete or ultraconservative removal of decayed tissue in
unfilled teeth. Cochrane Database Syst Rev 2006;3:CD003808
LITERATURA
8.

84
183. Roberts-Clark DJ, Smith AJ. Angiogenic growth factors in human dentine matrix. Arch Oral Biol
2000;45:1013-1016.
184. Rolland SL, McCabe JF, Imazato S, Walls AW. A randomised trial comparing the antibacterial effects of
dentine primers against bacteria in natural root caries. Caries Res 2011;45:574-580.
185. Roy S, Khanna S, Sen CK. Redox regulation of the VEGF signalling path and tissue vascularization:
Hydrogen peroxide, the common link between physical exercises and cutaneous wound healing. Free
Radic Biol Med 2008;44:180-192.
186. Saber SE, El-Askary FS. The outcome of immediate or delayed application of a single-step self etch
adhesive to coronal dentin following the application of different endodontic irrigants. Eur J Dent
2009;3:83-89.
187. Sagai M, Bocci V. Mechanisms of Action Involved in Ozone Therapy: Is healing induced via a mild
oxidative stress? Med Gas Res 2011;1:29.
188. Schaeken MJ, Keltjens HM, Van Der Hoeven JS. Effects of fluoride and chlorhexidine on the microflora
of dental root surfaces and progression of root-surface caries. J Den Res 1991;70:150-153.
189. Scheven BA, Man J, Millard JL, Cooper PR, Lea SC, Walsley AD, Smith AJ. VEGF and odontoblast-like
cells: Stimulation by low frequency ultrasound. Arch Oral Biol 2008;54:185-191.
190. Schmalz G. Agar overlay method. Int Endod J 1988;21:59-66
191. Schmalz G, Schweikle H, Esch J, Hiller KA. Evaluation of a dentine barrier test by cytotoxicity testing of
various dental cements. J Endod 1996;22:112-115.
192. Schmidlin PR, Zimmermann J, Bindl A. Effect of ozone on enamel and dentin bond strength. J Adhes
Dent 2005;7:29-32.
193. Schulze-Schweifing K, Banerjee A, Wade WG. Comparison of bacterial culture and 16S rRNA
community profiling by clonal analysis and pyrosequencing for the characterization of the dentine
caries-associated microbiome. Front Cell Infect Microbiol 2014;4:164.
194. Schwendicke F, Dorfer CE, Paris S. Incomplete caries removal: a systematic review and meta-analysis. J
Dent Res 2013a;92:306-314.
195. Schwendicke F, Meyer-Lueckel H, Dörfer C, Paris S. Failure of incompletely excavated teeth-a
systematic review. J Dent 2013b;41:569-580.
196. Schwendicke F, Stolpe M, Mexer-Lueckel H, Paris S, Dorfer CE. Cost-effectiveness of one- and two-step
incomplete and complete excavation. J Dent Res 2013c;92:880-887.
197. Segura JJ, Calvo JR, Guerrero JM, Jimenez-Planas A, Sampedro C, Llamas R. EDTA inhibits in vitro
substrate adherence capacity of macrophages: endodontic implications. J Endod 1997;23:205-208.
198. Segura JJ, Calvo JR, Guerrero JM, Sampedro C, Jimenez A, Llamas R. The disodium salt of EDTA inhibits
the binding of vasoactive intestinal peptide to macrophage membranes: endodontic implications. J
Endod 1996;22:337-340.
199. Selwitz RH, Ismail AI, Pits NB. Dental caries. Lancet 2007;368:51-59.
200. Shafiei F, Memarpour M. Antibacterial activity in adhesive dentistry: a literature review. Gen Den
2012;60:e346-356.
201. Shinohara MS, Bedran-de-Castro AK, Amaral CM, Pimenta LA. The effect of sodium hypochlorite on
microleakage of composite resin restorations using three adhesive systems. J Adhes Dent 2004;6:123-
127.
LITERATURA
8.

85
202. Simón-Soro A, Belda-Ferre P, Cabrera-Rubio R, Alcaraz LD, Mira A. A tissue-dependent hypothesis of
dental caries. Caries Res 2013;47:591-600.
203. Simón-Soro A, Guillen-Navarro M, Mira A. Metatranscriptomics reveals overall active bacterial
composition in caries lesions. J Oral Microbiol 2014;6:25443.
204. Simón-Soro A, Mira A. Solving the etiology of dental caries. Trends Microbiol 2015;23:76-82.
205. Siqueira JF Jr, Batista MM, Fraga RC, de Uzeda M. Antibacterial effects of endodontic irrigants on
black-pigmented gram-negative anaerobes and facultative bacteria. J Endod 1998;24:414-416.
206. Siso HS, Kustarci A, Goktolga EG. Microleakage in resin composite restorations after antimicrobial pre-
treatments: Effect of KTP laser, chlorhexidine gluconate and Clearfil Protect Bond. Oper Dent
2009;34:321-327.
207. Soares CJ, Pereira CA, Pereira JC, Santana FR, do Prado CJ. Effect of chlorhexidine application on
microtensile bond strength to dentin. Oper Dent 2008;33:183-188.
208. Soares DG, Basso FG, Hebling J, de Souza Costa CA. Concentrations of and application protocols for
hydrogen peroxide bleaching gels: effects on pulp cell viability and whitening efficacy. J Dent
2014a;42:185-198.
209. Soares DG, Pastana JV, de Oliveira Duque CC, Dias Ribeiro AP, Basso FG, Hebling J, de Souza Costa CA.
Influence of adhesive restorations on diffusion of H2O2 released from a bleaching agent and its toxic
effects on pulp cells. J Adhes Dent 2014b;16:123-128.
210. Soden RI, Botero TM, Hanks CT, Nör JE. Angiogenic signalling triggered by cariogenic bacteria in pulp
cells. J Dent Res 2009;88:835-840.
211. Sousa SM, Bramante CM, Taga EM. Biocompatibility of EDTA, EGTA and citric acid. Braz Dent J
2005;16:3-8.
212. Tahmassebi JF, Chrysafi N, Duggal MS. The effect of ozone on progression or regression of artificial
caries-like enamel lesions in vitro. J Dent 2014;42:167-174.
213. Takahashi N, Iwami Y, Yamada T. Metabolism of intracellular polysaccharide in the cells of
Streptococcus mutans under strictly anaerobic conditions. Oral Microbiol Immunol 1991;6:299-304.
214. Takahashi N, Nyvad B. The role of bacteria in the caries process: ecological perspective. J Dent Res
2011;90:294-303.
215. Thanomsub B, Anupunpisit V, Chanphetch S, Watcharachaipong T, Poonkhum R, Srisukonth C. Effects
of ozone treatment on cell growth and ultrastructural changes in bacteria. J Gen Appl Microbiol
2002;48:193-199.
216. Theilade E. The non-specific theory in microbial etiology of inflammatory periodontal diseases. J Clin
Periodontol 1986;13:905-911.
217. Toi CS, Bönecker M, Cleaton-Jones PE. Mutans streptococci strains prevalence before and after cavity
preparation during Atraumatic Restorative Treatment. Oral Microbiol Immunol 2003;18:160-164.
218. Torneck CD, Titley KC, Smith DC, Adibfar A. The influence of time of hydrogen peroxide exposure on
the adhesion of composite resin to bleached bovine enamel. J Endodon 1990;16:123–128.
219. Tran-Hung L, Laurent P, Camps J, About I. Quantification of angiogenic growth factors released by
human dental cells after injury. Arch Oral Biol 2008;53:9-13.
220. Tuncer D, Yazici AR, Ayturan S, Ozgunaltay G, Dayanganc B. Antimicrobial Effect of Ozone on
Cariogenic Microorganisms In Vitro. Ozone: Science & Engineering 2013;35:456-464.
LITERATURA
8.

86
221. Turkun M, Turkun LS, Ergucu Z, Ates M. Is an antibacterial adhesive system more effective than cavity
disinfectants? Am J Dent 2006;19:166-170.
222. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in normal
physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007;39:44-84.
223. van Loon J, Mars P. Biocompatibility. The latest developments. Med Device Technol 1997;8:20–24.
224. van Lunsen DM, de Soet JJ, Weerheijm KL, Groen HJ, Veerkamp JS. Effects of dental treatment and
single application of a 40% chlorhexidine varnish on mutans streptococci in young children under
intravenous anaesthesia. Caries Res 2000;34:268-274.
225. Vanuspong W, Eisenburger M, Addy M. Cervical tooth wear and sensitivity: erosion, softening, and
rehardening of dentine: effects of pH, time and ultrasonication. J Clin Parodontol 2002;29:351-357.
226. Varvara G, Pinchi V, Caputi S, D'Arcangelo C, Scarano A, Sinjari B, Murmura G. Copper-zinc superoxide
dismutase activity in dental pulp after dental preparation. J Biol Regul Homeost Agents 2012;26:769-
773.
227. Varvara G, Traini T, Esposito P, Caputi S, Perinetti G. Copper-zinc superoxide dismutase activity in
healthy and inflamed human dental pulp. Int Endod J 2005;38:195-199.
228. Vianna ME, Horz HP, Gomes BP, Conrads G. In vivo evaluation of microbial reduction after chemo-
mechanical preparation of human root canals containing necrotic pulp tissue. Int Endod J
2006;39:484-492.
229. Vieira Rde S, da Silva IA Jr. Bond strength to primary tooth dentin following disinfection with a
chlorhexidine solution: An in vitro study. Pediatr Dent 2003;25:49-52.
230. Virtej A, Løes S, Iden O, Bletsa A, Berggreen E. Vascular endothelial growth factors signalling in normal
human dental pulp: a study of gene and protein expression. Eur J Oral Sci 2013;121:92-100.
231. Walsh LJ. The current status of laser applications in dentistry. Aust Dent J 2003;48:146-155.
232. Wang Q, Lin XJ, Lin ZY, Liu GX, Shan XL. [Expression of vascular endothelial growth factor in dental
pulp of immature and mature permanent teeth in human]. Shanghai Kou Qiang Yi Xue 2007;16:285-
289.
233. Weerheijm KL, de Soet JJ, van Amerongen WE, de Graaff J. Sealing of occlusal hidden caries lesions: an
alternative for curative treatment? ASDC J Dent Child 1992; 59:263-268.
234. Weitzman SA, Weitberg AB, Stossel TP, Schwartz J, Shklar G. Effects of hydrogen peroxide on oral
carcinogenesis in hamsters. J Periodontol 1986;57:685-688.
235. Wicht MJ, Haak R, Schutt-gerowitt H, Kneist S, Noack MJ. Suppression of caries-related
microorganisms in dentine lesions after short-term chlorhexidine or antibiotic treatment. Caries Res
2004;38:436-441.
236. Wolff D, Frese C, Maier-Kraus T, Krueger T, Wolff B. Bacterial biofilm composition in caries and caries
free subjects. Caries Res 2013;47:69-77.
237. Xia D, Mo Z, Zhao G, Guo F, You C, Chen Z, Zhu X, Li Z, Chen D, Fan X. Nd:YAG Lasers Treating of
Carious Lesion and Root Canal In Vitro. International Journal of Photoenergy 2012; Article ID 584079
238. Yazıcıoğlu O, Ulukapı H. The investigation of non-invasive techniques for treating early approximal
carious lesions: an in vivo study. Int Dent J 2014;64:1-11.
239. Zaccaro Scelza MF, da Silva Pierro VS, Chagas MA, da Silva LE, Scelza P. Evaluation of inflammatory
response of EDTA, EDTA-T, and citric acid in animal model. J Endod 2010;36:515-519.
LITERATURA
8.

87
240. Zaura E, Buijs MJ, ten Cate JM. Effects of ozone and sodium hypochlorite on caries-like lesions in
dentin. Caries Res 2007;41:489-492.

Изјава о ауторству

Име и презиме аутора:  Јелена Крунић________________________________

Изјављујем

да
је
докторска
дисертација
под
насловом:
ОЗОН
У
РЕСТАУРАТИВНОЈ
СТОМАТОЛОШКОЈ ТЕРАПИЈИ: АНТИБАКТЕРИЈСКИ ЕФЕКАТ И УТИЦАЈ НА VEGF У
ЗУБНОЈ ПУЛПИ____________________________________________________

 резултат сопственог истраживачког рада;
 да докторска дисертација у цјелини ни у дјеловима није била предложена за стицање
било које дипломе на другим високошколским установама;
 да су резултати коректно наведени и
 да нисам кршио/ла ауторска права и користио/ла интелектуалну својину других
лица.

          Потпис аутора
                ___________________________

Мјесто: Фоча
Датум: 23.1.2023.

Изјава o истовјетности штампане и електронске верзије докторске
дисертације

Име и презиме аутора: Јелена Крунић__________________________________________
Наслов
рада:
ОЗОН
У
РЕСТАУРАТИВНОЈ
СТОМАТОЛОШКОЈ
ТЕРАПИЈИ:
АНТИБАКТЕРИЈСКИ ЕФЕКАТ И УТИЦАЈ НА VEGF У ЗУБНОЈ ПУЛПИ__________
Ментор: Проф. Др Драгица Стојић_____________________________________________

Изјављујем да је штампана верзија моје докторске дисертације истовјетна електронској
верзији коју сам предао/ла.
Ову изјаву дајем у сврху похрањивања моје докторске дисертације у Дигитални
репозиторијуму Универзитета у Источном Сарајеву.

          Потпис аутора
                ___________________________

Мјесто: Фоча
Датум: 23.1.2023.

Изјава о коришћењу

Овлашћујем Универзитет у Источном Сарајеву да унесе моју докторску дисертацију у
Дигитални репозиторијум под насловом:
ОЗОН У РЕСТАУРАТИВНОЈ СТОМАТОЛОШКОЈ ТЕРАПИЈИ: АНТИБАКТЕРИЈСКИ
ЕФЕКАТ И УТИЦАЈ НА VEGF У ЗУБНОЈ ПУЛПИ__________________________________
која је моје ауторско дело.
Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно
архивирање.
Моју докторску дисертацију похрањену у Дигиталном репозиторијуму Универзитета у
Источном Сарајеву и доступну у отвореном приступу могу да користе сви који поштују
одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за
коју сам се одлучио/ла.
 Ауторство (CC BY)
 Ауторство – некомерцијално (CC BY-NC)
 Ауторство – некомерцијално – без прерада (CC BY-NC-ND)
 Ауторство – некомерцијално – дијелити под истим условима (CC BY-NC-SA)
 Ауторство –  без прерада (CC BY-ND)
 Ауторство –  дијелити под истим условима (CC BY-SA)

       Потпис аутора
                ___________________________

Мјесто: Фоча
Датум: 23.1.2023.

1. Ауторство (CC BY).  Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање
дјела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца
лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци.
2. Ауторство - некомерцијално (CC BY-NC). Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и
јавно саопштавање дјела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране
аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дјела.
3. Ауторство - некомерцијално - без прерада (CC BY-NC-ND). Дозвољавате умножавање,
дистрибуцију и јавно саопштавање дјела, без промјена, преобликовања или употребе дјела у
свом дјелу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца
лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дјела. У односу на све остале
лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дјела.
 4. Ауторство - некомерцијално - дијелити под истим условима (CC BY-NC-SA).
Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дјела, и прераде, ако се
наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада
дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну
употребу дјела и прерада.
5. Ауторство - без прерада (CC BY-ND). Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно
саопштавање дјела, без промјена, преобликовања или употребе дјела у свом дјелу, ако се
наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца
дозвољава комерцијалну употребу дјела.
6. Ауторство – делити под истим условима (CC BY-SA). Дозвољавате умножавање,
дистрибуцију и јавно саопштавање дјела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин
одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или
сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дјела и прерада. Слична
је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.

Напомена: Овај текст није саставни дио изјаве аутора о коришћењу, већ представља
објашњење појединих лиценци.